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第一部分半枝莲药材质量研究一、半枝莲药材指纹图谱研究目的:建立中药材半枝莲的HPLC指纹图谱,获得对照图谱,并与不同产地半枝莲药材指纹特征相比较,为科学评价与有效控制半枝莲药材质量提供新方法。方法:（1）提取:比较了不同提取方法、提取溶剂及提取时间的提取效果,选择提取成分较多,提取率较高的提取条件。（2）色谱条件:选用合适的色谱柱及检测器,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,选择最佳的色谱条件,使色谱图符合指纹图谱研究的要求。（3）系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中参照物野黄芩苷峰的分离度和理论板数。（4）精密度试验:取同一份供试品溶液,重复进样6次,记录保留时间和峰面积,同时比较所得指纹图谱的相似度。（5）重复性试验:取同一批半枝莲药材6份,平行制备供试品溶液,分别进样,记录保留时间和峰面积,同时比较所得指纹图谱的相似度。（6）稳定性试验:取同一份供试品溶液分别于0、2、4、6、8、24、36、48h进样,记录保留时间和峰面积,同时比较所得指纹图谱的相似度。（7）指纹图谱的建立:分别取不同产地的半枝莲药材23批、对照药材1批和混淆品6批样品制备供试品溶液,进行指纹图谱分析。结果:（1）提取:最佳提取条件为用60%乙醇超声提取60min。（2）色谱条件:采用C18色谱柱;甲醇-乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱,流速为1mL·min-1,柱温为30℃,UV检测器,进样量为20μL。（3）系统适用性试验:按野黄芩苷峰计算理论板数约为4500,与其它色谱峰的分离度大于1.5。（4）精密度试验:以野黄芩苷峰为内参比峰,计算各主要色谱峰相对保留时间和占总峰面积5%以上色谱峰的相对峰面积,其RSD分别为0.13%～0.71%和1.1%～2.8%,同时所得指纹图谱相似度均高于0.97,符合指纹图谱测定要求,精密度良好。（5）重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间和占总峰面积5%以上色谱峰的相对峰面积均无明显变化,其RSD分别为0.05%～0.44%和1.1%～2.0%,同时所得指纹图谱相似度均高于0.98,符合指纹图谱测定要求,重复性良好。（6）稳定性试验:各主要色谱峰相对保留时间及占总峰面积5%以上色谱峰的相对峰面积均无明显变化,其RSD分别为0.10%～0.82%和1.0%～2.6%,同时所得指纹图谱相似度均高于0.97,符合指纹图谱测定要求,稳定性良好。（7）指纹图谱的建立:得到不同来源半枝莲药材及其混淆品的指纹图谱。（8）数据分析:运用相似度软件对所得数据进行分析,所得结果能有效反映不同产地半枝莲药材的质量。结论:本文建立了中药材半枝莲的HPLC-UV指纹图谱,并与不同产地的半枝莲药材及其混淆品进行了比较,利用相似度软件对不同产地半枝莲药材间的差异进行了研究,对其质量进行了综合评价,方法重复性和精密度良好,有助于半枝莲药材的标准化种植及质量控制。二、半枝莲中黄酮类成分的含量测定目的:建立高效液相色谱法测定半枝莲中6种黄酮类成分的含量,同时测定各样品中总黄酮的含量,为半枝莲药材的质量评价提供有效手段和依据。方法:1六种黄酮类成分同时测定（1）提取:比较不同提取方法、提取溶剂及提取时间的提取效果,选择提取高的提取条件。（2）色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相的组成、配比、流速,使各待测成分色谱峰的分离度均符合测定的要求。（3）标准曲线的制备:配制一系列浓度的混合对照品溶液,测定峰面积;以峰面积为纵坐标,以浓度为横坐标,绘制标准曲线,经回归处理得各标准曲线方程。（4）检测限试验:将混合对照品溶液逐步稀释,当信噪比S/N≥3时确定为检测限。（5）精密度试验:取同一份样品溶液,重复进样6次,测定峰面积,计算仪器精密度;取同一样品,每日精密称取6份,制备溶液,进样测定,连续测定3日。根据测定结果分别计算日内精密度和日间精密度。（6）稳定性试验:取样品溶液分别于0、2、4、6、8、24h进样测定。（7）回收率试验:取已知含量的药材9份,每份约0.1g,精密称定,分别精密加入一定量的对照品,制备供试品溶液,进样测定高、中、低3种浓度的回收率。（8）样品测定:在上述色谱条件下,测定不同来源半枝莲药材中各待测成分的含量。2总黄酮的测定（1）标准曲线的制备:配制一系列浓度的混合对照品溶液,测定吸光度;以野黄芩苷的浓度(mg·mL-1)为横坐标,相应的吸光度值为纵坐标,制备标准曲线。（2）样品测定:依法制备各供试品溶液,测定所有半枝莲药材中总黄酮的含量。结果:1六种黄酮类成分同时测定（1）提取:用75%甲醇回流提取60min,能够将各待测成分提取完全,且方法稳定。（2）色谱条件:采用C18色谱柱,以甲醇-乙腈-0.05%磷酸为流动相梯度洗脱,采用波长转换方法检测,各待测物检测波长依次为335nm、350nm、288nm、335nm、275nm、275nm。在此色谱条件下,各待测组分与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5,以野黄芩苷计理论板数大于6000。（3）标准曲线的制备:各待测组分线性关系良好。（4）检测限试验:1-6的检测限分别为0.056、0.015、0.033、0.037、0.015、0.008μg?mL-1。（5）精密度试验:方法的精密度良好,其仪器精密度、日内及日间精密度的RSD均小于3%。（6）稳定性试验:供试品溶液在24h内基本稳定,1-6的RSD分别为0.68%、1.2%、0.95%、1.1%、1.9%、1.1%。（7）回收率试验:高、中、低3种浓度的平均回收率在95%99%之间,RSD小于3%。（8）依据上述色谱条件进行分析,由标准曲线计算得到各个样品中各待测组分的含量。2总黄酮的测定（1）标准曲线的制备:回归方程:Y=53.15X-2.3×10-3,r=0.9992（n=5）,野黄芩苷在3.667～18.34μg·mL-1范围内,与吸光度呈良好的线性关系。（2）依据上述条件进行分析,由标准曲线计算得到各个样品中总黄酮的含量。结论:本研究首次建立了高效液相色谱法同时测定半枝莲中六种黄酮类成分的含量。采用波长转换法以各待测组分的最大吸收波长作为相应组分的检测波长,提高了检测灵敏度,方法简便快速、结果准确可靠,专属性强,精密度和稳定性良好,可用于半枝莲中黄酮类成分的质量控制。三、半枝莲中原儿茶酸的含量测定目的:建立高效液相色谱法测定半枝莲中原儿茶酸的含量,为半枝莲药材的质量评价提供有效手段。方法:（1）提取:比较不同的提取方法,并对各种影响因素进行考察,选择最佳的提取条件。（2）色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相的组成、配比、流速,使原儿茶酸色谱峰的分离符合测定的要求。（3）标准曲线的制备:配制一系列浓度的原儿茶酸对照品溶液,测定峰面积;以原儿茶酸的含量为横坐标,相应的峰面积（×107）为纵坐标,制备标准曲线。（4）检测限试验:将原儿茶酸对照品溶液逐步稀释,当信噪比S/N≥3时确定为检测限。（5）稳定性试验:取样品溶液分别放置0、2、4、6、8、12、24h后进样测定峰面积。（6）精密度试验:取同一份样品溶液,重复进样6次,测定峰面积。（7）重复性试验:取半枝莲药材平行制备样品溶液6份,测定峰面积,计算各供试品溶液中原儿茶酸含量,求得其RSD。（8）回收率试验:取已知原儿茶酸含量的半枝莲药材,分别加入适量的原儿茶酸对照品,各平行制备同一浓度的样品6份。（9）样品测定:在上述色谱条件下,由标准曲线计算得到各个样品中原儿茶酸的含量。结果:（1）提取:30%乙醇回流提取法,具有稳定和效率高等优点。（2）色谱条件:采用C18色谱柱,以甲醇-0.05%磷酸（25:75）为流动相,流速为1.0mL·min-1,进样量为20μL,检测波长为258nm。在此色谱条件下,原儿茶酸的保留时间约为7min,样品色谱峰的分离度大于1.5,理论板数大于6000。（3）标准曲线的制备:回归方程为Y=4.095X-1.401×10-3,r=0.9998（n=6）,原儿茶酸在0.018～0.184μg范围内,呈良好的线性关系。（4）检测限试验:原儿茶酸的检测限为3ng。（5）稳定性试验:样品溶液在24h内稳定,其RSD为1.0%。（6）精密度试验:方法的精密度良好,其RSD值为0.41%。（7）重复性试验:方法的重复性好,原儿茶酸的含量和RSD分别为59.610μg·g-1和0.86%。（8）回收率试验:方法的回收率和RSD分别为98.2%和0.95%。（9）依据上述色谱条件进行分析,由标准曲线计算得出了24批样品中原儿茶酸的含量。结论:本文首次建立了高效液相色谱法测定半枝莲中原儿茶酸含量的方法。该法简便快速、结果准确可靠,专属性强,精密度和稳定性良好,可用于半枝莲中原儿茶酸的质量控制。第二部分注射用银杏叶提取物质量研究一、注射用银杏叶提取物指纹图谱研究目的:建立注射用银杏叶提取物的HPLC指纹图谱,获得对照图谱,并与不同批次指纹特征相比较,有效控制注射用银杏叶提取物的质量。方法:（1）色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相的组成、配比、流速,选择最佳的色谱条件,使色谱图符合指纹图谱研究的要求。（2）系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中参照物芦丁峰的分离度和理论板数。（3）专属性试验:精密吸取阴性对照溶液、供试品溶液及对照品溶液,进样,记录75min内的色谱图。（4）精密度试验:取同一份供试品溶液,重复进样6次,记录保留时间和峰面积,同时比较所得指纹图谱的相似度。（5）重复性试验:取平均装量项下内容物6份,制备供试品溶液,进样,记录保留时间和峰面积,同时比较所得指纹图谱的相似度。（6）稳定性试验:取同一份供试品溶液分别于0、2、4、6、8、24h进样,记录保留时间和峰面积,同时比较所得指纹图谱的相似度。（7）指纹图谱的建立:分别取原料、中间体及注射用银杏叶提取物各10批制备供试品溶液,进行指纹图谱分析。（8）数据分析:运用相似度软件对所得数据进行分析。结果:（1）色谱条件:采用C18色谱柱;乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱,流速为1mL·min（-1）,柱温35℃,进样量为20μL。（2）系统适用性试验:按芦丁峰计算理论板数约为3500,与其它色谱峰的分离度大于1.5。（3）专属性试验:空白辅料对供试品溶液中各色谱峰无干扰。（4）精密度试验:各主要色谱峰相对保留时间和占总峰面积5%以上色谱峰的相对峰面积的RSD分别为0.04%～0.36%和0.10%～0.52%,同时所得指纹图谱相似度均高于0.98,精密度良好。（5）重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间和占总峰面积5%以上色谱峰的相对峰面积的RSD分别为0.03%～0.31%和0.25%～0.73%,同时所得指纹图谱相似度均高于0.97,重复性良好。（6）稳定性试验:各主要色谱峰相对保留时间及占总峰面积5%以上色谱峰的相对峰面积的RSD分别为0.03%～0.34%和0.59%～1.6%,同时所得指纹图谱相似度均高于0.96,稳定性良好。（7）指纹图谱的建立:得到原料、中间体及注射用银杏叶提取物各10批的指纹图谱。（8）数据分析:所得结果能有效反映不同批次注射用银杏叶提取物的质量。结论:本文建立了注射用银杏叶提取物的HPLC-UV指纹图谱,并与不同批次进行了比较,利用相似度软件对不同批次注射用银杏叶提取物药材间的差异进行了研究,方法重复性和精密度良好,有助于注射用银杏叶提取物的质量控制。二、注射用银杏叶提取物总黄酮醇苷的含量测定目的:建立高效液相色谱法测定注射用银杏叶提取物中总黄酮醇苷的含量,为注射用银杏叶提取物的质量评价提供有效手段。方法:（1）色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相的配比,使各待测成分色谱峰的分离度均符合测定的要求。（2）系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察色谱图中各待测物峰的分离度,按槲皮素峰计算理论板数。（3）专属性试验:精密吸取阴性对照溶液、供试品溶液及对照品溶液,进样,记录45min内的色谱图。（4）标准曲线的制备:配制一系列浓度的混合对照品溶液,测定峰面积;以峰面积为纵坐标,以浓度为横坐标,绘制标准曲线,经回归处理得各标准曲线方程。（5）检测限试验:将混合对照品溶液逐步稀释,当信噪比S/N≥3时确定为检测限。（6）精密度试验:取同一份样品溶液,重复进样6次,测定峰面积。（7）重复性试验:取同一批样品6份,制备供试品溶液,进样测定。（8）稳定性试验:取样品溶液分别于0、2、4、6、8、24h进样测定。（9）回收率试验:取已知含量的样品6份,每份约0.22g,精密称定,分别精密加入一定量的对照品,制备供试品溶液,进样测定。（10）样品测定:取原料、中间体及注射用银杏叶提取物各10批分别制备供试品溶液,进样测定,计算含量。结果:（1）色谱条件:采用C18色谱柱,以甲醇-0.4%磷酸为流动相梯度洗脱,于360nm处检测。（2）系统适用性试验:在此色谱条件下,各待测组分与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5,以槲皮素计理论板数大于6500。（3）专属性试验:空白辅料的色谱峰对供试品溶液中各色谱峰无干扰。（4）标准曲线的制备:槲皮素、山柰素和异鼠李素的回归方程分别为Y=9.050×104X-1.827×104 , r=0.9993 （ n=5 ）、Y=8.143×104X-0.7202×104 , r=0.9998 （ n=5 ）和Y=1.052×105X-0.4654×104,r=0.9993（n=5）,线性范围分别为5.10451.04μg·mL-1、5.050μg·mL-1与1.3813.8μg·mL-1。（5）检测限试验:槲皮素、山柰素和异鼠李素的检测限分别为5、8和12ng。（6）精密度试验:方法的精密度良好,精密度的RSD均小于3%。（7）重复性试验:方法的重复性良好,重复性的RSD均小于3%。（8）稳定性试验:供试品溶液在24h内基本稳定,RSD均小于3%。（9）回收率试验:平均回收率均大于98%,RSD均小于3%。（10）依据上述色谱条件进行分析,由外标一点法计算得到各个样品中各待测组分的含量。结论:本研究采用高效液相色谱法测定了注射用银杏叶提取物黄酮类成分的含量。方法简便快速、结果准确可靠,专属性强,精密度和稳定性良好,可用于注射用银杏叶提取物中黄酮类成分的质量控制。三、注射用银杏叶提取物萜类内酯的含量测定目的:建立高效液相色谱法测定注射用银杏叶提取物中萜类内酯的含量,为注射用银杏叶提取物的质量评价提供有效手段。方法:（1）选用合适的色谱柱,调整流动相的组成、配比、流速,使各待测成分色谱峰的分离度均符合测定的要求。（2）系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察色谱图中各待测物峰的分离度,按白果内酯峰计算理论板数。（3）专属性试验:精密吸取阴性对照溶液、供试品溶液及对照品溶液,进样,记录25min内的色谱图。（4）标准曲线的制备:配制一系列浓度的混合对照品溶液,测定峰面积;以峰面积对数为纵坐标,以浓度对数为横坐标,绘制标准曲线,经回归处理得各标准曲线方程。（5）检测限试验:将混合对照品溶液逐步稀释,当信噪比S/N≥3时确定为检测限。（6）精密度试验:取同一份样品溶液,重复进样6次,测定峰面积。（7）重复性试验:取同一批样品6份,制备供试品溶液,进样测定。（8）稳定性试验:取样品溶液分别于0、2、4、6、8、10、24h进样测定。（9）回收率试验:取已知含量的6份,每份约0.6g,精密称定,分别精密加入一定量的对照品,制备供试品溶液,进样测定。（10）样品测定:取原料、中间体及注射用银杏叶提取物各10批分别制备供试品溶液,进样测定,计算含量。结果:（1）色谱条件:采用C18色谱柱,以甲醇-水为流动相梯度洗脱,蒸发光检测器检测。（2）系统适用性试验:在此色谱条件下,各待测组分与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5,以白果内酯计理论板数大于5000。（3）专属性试验:空白辅料的色谱峰对供试品溶液中各色谱峰无干扰。（4）标准曲线的制备:银杏内酯A、B、C和白果内酯回归方程分别为lgY=1.33lgX+7.83（r=0.9989,n=5）、lgY=1.32lgX+ 7.79（r=0.9993,n=5）、lgY=1.40lgX+8.03（r=0.9990,n=5）、lgY=1.24lgX+4.81 （ r = 0.9994 , n=5 ）,线性范围分别为0.04120.3708mg·mL-1、0.02550.2295mg·mL-1、0.0293 0.2637mg·mL-1和0.06650.5985mg·mL-1,（5）检测限试验:银杏内酯A、B、C和白果内酯的检测限分别为8、15、13和11ng。（6）精密度试验:方法的精密度良好,精密度的RSD均小于3%。（7）稳定性试验:供试品溶液在24h内基本稳定,其RSD均小于3%。（8）回收率试验:平均回收率均大于97%,RSD均小于3%。（9）依据上述色谱条件进行分析,由外标两点对数法计算得到各个样品中各待测组分的含量。结论:本研究采用高效液相色谱法测定了注射用银杏叶提取物萜类内酯的含量。方法简便快速、结果准确可靠,专属性强,精密度和稳定性良好,可用于注射用银杏叶提取物中萜类内酯成分的质量控制。