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D-对羟基苯甘氨酸是半合成β-内酰胺类抗生素的重要原料,海因酶法是普遍采用的D-对羟基苯甘氨酸工业生产方法。海因酶法就是采用D-海因酶和N-氨甲酰水解酶催化D,L-对羟基苯海因,转化为D-对羟基苯甘氨酸的生物化学方法。本文以枯草芽孢杆菌为受体菌,共表达异源的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶,作为海因酶法合成D-对羟基苯甘氨酸的全细胞催化剂。本文对于D-海因酶的选择、重组菌的构建和影响全细胞催化活性的一些重要因素进行了研究。采用Paco表达盒诱导表达D-海因酶基因（sd1或hyd）,采用PAE表达盒表达N-氨甲酰水解酶基因（adc）。以质粒pHP13为载体,分别构建PAE-adc-Paco-sd1基因和PAE-adc-Paco-hyd基因共表达质粒pHCY和pHCS。枯草芽孢杆菌168/pHCY和168/pHCS的全细胞催化活性,分别为0.25 U/mL和0.36 U/mL。在枯草芽孢杆菌168N的染色体上,整合表达acoR基因和sigL基因,构建了重组菌株WD-3。qRT-PCR分析显示,WD-3菌株胞内acoR和sigL基因的mRNA水平平均提高了248.2倍和80.7倍,表明acoR和sigL基因在WD-3菌株中被过表达。WD-3/pHCS菌株的全细胞催化活性达到0.56 U/m L,比168/pHCS提高了80%。结果表明,提高激活蛋白AcoR和σL因子的胞内水平,对于维持多拷贝Paco表达盒的正常转录功能是必要的。以pUB110质粒为基础,构建了adc-sd1共表达重组质粒pUCS。WD-3/pUCS全细胞催化活性达到0.98 U/mL,比WD-3/pHCS的0.56 U/mL提高了75%。结果表明,提高adc和sd1基因剂量,对于提高重组菌的全细胞催化活性是有效的。敲除WD-3菌株的sdp和skf基因,构建双缺陷株WD-5。WD-5/pUCS菌株与WD-3/pUCS相比,全细胞催化活性相当;但是在培养体系和催化反应体系中,芽孢量会高一个数量级;在反应体系中,全细胞催化活性的衰减速率显著降低。因此,sdp和skf基因缺陷,虽然导致更多的细胞形成芽孢,但是由于消除了姊妹细胞之间的自相残杀,而有利于全细胞催化活性的维持。敲除WD-5菌株的kinA和kinB基因,构建重组菌WD-7。WD-7/pUCS完全不形成芽孢,同时具有与WD-5/pUCS菌株相当的全细胞催化活性和衰减特征。