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柯萨奇病毒属细小RNA病毒科肠道病毒属，柯萨奇B3病毒（CVB3）作为代表性的柯萨奇病毒，是CVB的6个血清型中致病性最强的一型，其感染与急、慢性心肌炎和扩张性心脏病高度相关，已成为较严重的社会健康问题，对其致病机制的研究以及相关的防治研究日益受到人们的重视。CVB3为球型二十面体对称无包膜病毒，其核衣壳由四种共60个结构蛋白质VP1、VP2、VP3和VP4组成。作为肠道感染病毒，CVB3在pH 3~10范围内稳定，并通过与细胞膜上的CAR/CD55/DAF结合宿主细胞，导致隐藏于核衣壳内部的VP4和VP1蛋白暴露于病毒表面，促进细胞膜对CVB3的包裹和摄入。由于CVB3系粘膜感染病毒，其致病机制与CVB3对心肌细胞直接和间接的病理损伤有关，因此诱生粘膜免疫和特异性细胞免疫应答是预防及治疗CVB3病毒性心脏病的重要措施。DNA疫苗自90年代发展以来，具有诱生全面有效的免疫应答并且易于诱生特异性CTL的特性，在抗感染和抗病毒免疫中具有独特的优势。为诱生CVB3特异性体液及细胞免疫应答，本课题前期研究发现以50?g编码CVB3 结构蛋白VP1的质粒DNA经肌肉免疫BALB/c小鼠三次，可诱生CVB3特异性免疫应答，并具有一定的免疫保护作用。然而该DNA疫苗仅诱生了较高水平的IgM和IgG，不能诱生粘膜IgA，而良好的粘膜免疫应答在抗CVB3早期感染中扮演着重要的角色。如何更好地诱生CVB3特异性粘膜免疫应答成为本研究的主要设计思路。甲壳类动物来源的天然生物多糖chitosan证实具有增强粘膜吸收、促进胞间运输、缓释和生物可降解等多种良好特性，已被用于药物赋形剂与缓释剂。为此，本研究综合DNA疫苗诱生体液及细胞免疫的优势、chitosan增强粘膜吸收和缓释的特性，设计了旨在增强粘膜免疫应答的chitosan-DNA疫苗。在此基础上通过引入双功能“载体多肽”HA-pLys16，进一步构建了chitosan-DNA-HApLys16新型疫苗。通过对这两种新型疫苗的体内外表达研究、免疫BALB/c小鼠后诱生的特异性免疫应答研究、抗病毒攻击试验以及对其预防病毒性心肌炎的研究，获得以下结果：一、新型chitosan-DNA疫苗的构建和生物学特性研究<WP=6>自Hela细胞培养上清中的CVB3（Nancy株）提取病毒总RNA，经逆转录得到CVB3的总cDNA，以cDNA为模板，根据文献设计的主要结构蛋白VP1的上下游引物，扩增得到VP1编码852bp基因片段，以Hind III和Bam HI双酶酶切，连接入同样以双酶酶切的pcDNA3质粒中，构建了pcDNA3-VP1质粒。经PCR鉴定、双酶切鉴定和DNA测序，证实该质粒构建的正确性。体外将该质粒转染Hela细胞，检测上清中VP1蛋白的表达情况，发现pcDNA3-VP1在Hela细胞中可有效表达，表达可持续至72小时。在此基础上，分别配制0.02%的chitosan溶液和pcDNA3-VP1溶液，在pH5.5和高速振荡下，形成chitosan-pcDNA3-VP1（以下简称chitosan-DNA）复合物颗粒。从颗粒形态、保护DNA能力和体外表达几方面研究了该复合物的特性：1）透射电镜证实chitosan-DNA复合物为均一的、直径约为80～100nm的球形颗粒。2）以DNase I处理chitosan-DNA复合物，而后再以chitosanase酶消化chitosan，发现包裹在chitosan中的质粒DNA可被完整地释放出来，不被DNase I降解，提示chitosan具有保护DNA免遭降解的功能。3）为检测chitosan-DNA复合物的转染效率和表达时相，以含1?g pEGFP的chitosan-DNA直接滴加于Hela细胞表面，以1?g pEGFP以及pEGFP－Lipofactamine为对照，观察荧光表达情况，发现chitosan-DNA的表达显著高于DNA的表达，在时相上，该复合物转染24小时仅有少量表达，48小时后，绿色荧光的发光面积和强度都有所增高，虽不及pEGFP-Lipofactamine表达，但显著高于单纯DNA对照，证实chitosan可增强质粒DNA在上皮细胞中的瞬时表达。4）以chitosan-pcDNA3-VP1转染Hela细胞，ELISA法检测上清中VP1蛋白的表达，发现chitosan-DNA复合物中VP1的表达低于pcDNA3-VP1质粒-Lipofactamine的表达水平，但显著高于pcDNA3-VP1质粒直接转染细胞后的表达，提示chitosan的加入可增强复合物中基因的表达。二、chitosan-DNA疫苗诱生的特异性免疫及免疫保护作用为探明chitosan-DNA疫苗是否可在动物体内诱生CVB3特异性免疫和保护性免疫应答，首先摸索了最佳的免疫方式，以含50?g pcDNA3-VP1剂量的chitosan-DNA于0天、10天、31天，以肌注、口服、滴鼻三种途径免疫小鼠三次，总剂量150?g，免疫3次后4周以5(LD50 的CVB3致死性攻击小鼠，观察各组小鼠的存活情况。结果发现：chitosan-DNA滴鼻组可保护33.3%小鼠长期存活；口服组仅达到16.7%的保护率；肌注组无保护作用。提示滴鼻免疫途径可能<WP=7>是chitosan-pcDNA3-VP1基因疫苗最适的免疫途径。而后研究了chitosan-DNA经滴鼻免疫后在鼻咽原位的表达情况。以pcDNA3.1-Hygro-LacZ质粒作为模式质粒，分别以50?g的 chitosan-DNA、DNA、pcDNA3经滴鼻免疫BALB/c小鼠，5天后取小鼠鼻咽部，以X-Gal底物显色，结果发现pcDNA3滴鼻小鼠鼻咽仅有微量染色；DNA滴鼻有少量着色，而chitosan-DNA组在鼻咽的咽周围组织均显示较深的蓝色着色，其反面（鼻咽之鼻部）亦有较深着色，提示chitosan-DNA可增强DNA在鼻咽的原位表达。随后