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[目的]探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSC)调控的肾小管上皮细胞内miRNA在肾纤维化进展中的生物学功能和分子机制,为BM-MSC治疗肾纤维化提供新的临床治疗分子靶点和新的肾纤维化预后生物标志物。[方法]第一部分:体内外实验验证BM-MSC对肾纤维化的影响:1、构建顺铂诱导的C57BL/6小鼠肾纤维化模型,并通过尾静脉注射小鼠BM-MSC悬液,收取小鼠肾脏组织,利用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H&E)、Masson染色、天狼星红(Sirius red)染色观察肾脏组织中纤维化程度;2、利用实时荧光定量PCR和免疫蛋白质印迹(Western blot)方法检测BM-MSC对新鲜小鼠肾脏组织中肌动蛋白α(Alpha-smooth muscle,α-SMA)、Ⅰ 型胶原α1(collagen type Ⅰ alpha 1 chain,Col1α1)mRNA及蛋白表达水平的影响;3、收取肾纤维化小鼠模型血清,检测血清肌酐(Cre),尿素氮(BUN)表达水平;4、利用外源性细胞因子TGF-β1刺激小鼠肾小管上皮细胞(mouse renal tubular epithelial cells,mRTEC)后与 BM-MSC 共培养,利用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测共培养后mRTEC细胞中α-SMA、Col1α1 mRNA及蛋白的表达水平。第二部分:筛选并验证BM-SMC调控的mRTEC中的靶miRNA:1、利用外源性细胞因子TGF-β1刺激mRTEC后与BM-MSC共培养,收取mRTEC利用miRNA高通量测序(查询号GSE148144)筛选检测与未经共培养处理的mRTEC细胞相比差异性表达的miRNA,然后选取高表达改变最明显的五种miRNA,利用实时荧光定量PCR验证并筛选出与BM-MSC共培养后高表达改变最明显的miRNA,即miR-146a-5p;2、应用实时荧光定量PCR和Western blot法检测转染miR-146a-5p模拟物(mimic)后,经外源性细胞因子TGF-β1刺激的mRTEC中α-SMA、Col1α1 mRNA及蛋白的表达水平;3、应用实时荧光定量PCR和Western blot法检测转染miR-146a-5p抑制物(inhibitor)后,经外源性细胞因子TGF-β1刺激的mRTEC中α-SMA、Col1α1 mRNA及蛋白的表达水平。第三部分:miR-146a-5p靶基因的筛选与验证:1、利用实时荧光定量PCR筛选出在外源性细胞因子TGF-β1刺激下mRTEC中表达水平升高的候选靶基因;2、应用实时荧光定量PCR和Western blot法检测转染miR-146a-5p mimic后,mRTEC中候选靶基因Tfdp2的mRNA和蛋白水平的表达改变;3、应用实时荧光定量PCR检测转染不同浓度梯度的miR-146a-5p mimic后,mRTEC中候选靶基因Tfdp2的mRNA表达水平变化。第四部分:Tfdp2抗肾纤维化作用验证:1、应用实时荧光定量PCR检测Tfdp2 siRNA对mRTEC中Tfdp2表达水平的抑制效率;2、应用实时荧光定量PCR和Western blot 法检测 Tfdp2 siRNA 对 mRTEC 中α-SMA、Col1α1 mRNA 及蛋白表达水平的影响;3、免疫组化染色观察肾纤维化模型小鼠肾脏组织中肾小管上皮细胞Tfdp2表达水平。[结果]第一部分:1、顺铂诱导的C57BL/6小鼠肾纤维化模型中,接受尾静脉注射BM-MSC细胞悬液的小鼠肾脏纤维化程度比接受尾静脉注射生理盐水的小鼠更轻;2、尾静脉注射BM-MSC的肾纤维化小鼠肾脏α-SMA、Col1α1的mRNA和蛋白表达降低;3、尾静脉注射BM-MSC的肾纤维化小鼠血清Cre、BUN表达降低;4、与BM-MSC共培养的mRTEC中α-SMA、Col1α1 mRNA和蛋白水平表达降低。第二部分:1、miRNA高通量测序结果表明,外源性细胞因子TGF-β1刺激mRTEC后与BM-MSC共培养,mRTEC细胞中表达升高改变最明显的前五个miRNA 是 miR-146a-5p、miR-12194-3p、let-7i-3p、miR-210-5p 和 miR-210-3p;2、经实时荧光定量PCR验证这五个miRNA的表达水平,其中升高改变最明显的是miR-146a-5p;3、转染 miR-146a-5p mimic 后,外源性细胞因子 TGF-β1 刺激的 mRTEC中α-SMA,Col1α1 mRNA和蛋白的表达水平明显降低;4、转染miR-146a-5p inhibitor后,外源性细胞因子TGF-β1刺激的mRTEC中α-SMA、Col1α1 mRNA和蛋白的表达水平明显升高。第三部分:1、在mRTEC中,Tfdp2 mRNA在外源性细胞因子TGF-β1刺激下表达水平明显升高;2、转染miR-146a-5p mimic后,mRTEC中候选靶基因Tfdp2的mRNA和蛋白的表达水平明显降低;3、候选靶基因Tfdp2的表达水平随着mRTEC中miR-146a-5p mimic转染浓度的升高而下降。第四部分:1、Tfdp2 siRNA可以有效抑制mRTEC中Tfdp2 mRNA的表达水平;2、Tfdp2 siRNA能够降低经外源性细胞因子TGF-β1刺激的mRTEC中α-SMA、Col1α1 mRNA和蛋白的表达;3、尾静脉注射BM-MSC的肾纤维化小鼠肾小管上皮细胞的Tfdp2免疫组化染色阳性的细胞核比例降低。[结论]在肾纤维化进程中,细胞因子TGF-β1的浓度升高可以使下游miR-146a-5p的表达水平受到抑制,这种抑制作用使miR-146a-5p对其下游靶基因Tfdp2的抑制调控作用减弱,从而使靶基因Tfdp2表达水平上升,靶基因Tfdp2表达水平的上升又会使mRTEC内α-SMA、Col1α1的表达增加,从而促进了肾纤维化进程。BM-MSC可以通过使肾小管上皮细胞中miR-146a-5p高表达,使得miR-146a-5p对下游靶基因Tfdp2的抑制调控作用增强,靶基因Tfdp2表达水平降低使得α-SMA和Col1α1表达下降,从而达到治疗肾纤维化的作用。