一、背景和目的肺癌是全球发病率和死亡率最高的肿瘤,云南省宣威地区在全国乃至世界上都是肺癌高发区,具有地区特异性。该地区肺癌的病因被认为与室内大量煤烟熏染有关。但近期研究发现除了传统认为的环境因素外,还发现宣威女性肺癌在细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)；肺癌端粒酶RNA成分及Ki一67抗原；p53突变和突变位等与非宣威地区肺癌有明显的差异性,这就提示我们宣威肺癌有其自身的特点。因为早期诊断困难,多数患者确诊时已到晚期,失去手术根治机会,化疗在其综合治疗中占有重要地位。然而化疗药物耐药往往是影响患者近期疗效和远期生存的原因。现代分子生物学和基因工程技术的发展证实了和其他肿瘤一样肺癌在本质上是一种多基因病,因此人们开始尝试对恶性肿瘤产生和发展步骤中的关键基因和蛋白进行干预,以期能达到预防和治疗肿瘤的目的。反义技术作为基因疗法的一种,主要是根据碱基互补配对原则和核酸杂交原理,利用人工合成、天然存在的互补寡核普酸片段,与目的基因(单链、双链DNA)或mRNA的特定序列结合,从基因复制、转录、剪接、翻译等水平上调节靶基因的表达,干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递,从而达到抑制、封闭或破坏靶基因的目的。那么云南宣威地区肺腺癌患者中几种耐药蛋白的表达情况如何,我们是否能够通过反义寡核苷酸的应用来促进肿瘤细胞的凋亡,提高化疗的敏感性。因此我们拟通过本项研究初步探讨云南宣威地区肺腺癌中部分耐药蛋白的表达情况,以及通过反义寡核苷酸的干扰后对其的影响。第一部分探讨Survivin、RRMl、ERCCl、 BRCAl四个耐药蛋白在宣威地区和非宣威地区中的表达的差异,同时了解其与年龄、性别、临床分期之间的关系。第二部分构建Survivin反义寡核苷酸将其转染入宣威肺腺癌细胞XWLC-05,探讨其对细胞周期、凋亡等的影响。第三部分探讨Survivin反义寡核苷酸转染后对宣威肺腺癌细胞XWLC-05中SurvivinmRNA和Survivin蛋白表达的影响及其规律。并且探讨是否能够对化疗药物多西他赛起到增敏作用。第四部分采用宣威肺腺癌细胞XWLC-05裸鼠转移瘤模型进行动物实验,进一步探讨Survivin反义寡核苷酸(SurvivinASODN)在体内是否能够抑制转移瘤的生长,以及与多西他赛联合应用的效果如何。以期为Survivin反义寡核苷酸在宣威肺癌临床基因治疗中的应用提供思路及实验依据。二、方法1.选取2007年1月～2009年7月间云南省肿瘤医院临床肺癌研究中心的住院手术病例,对其标本采用免疫组化方法检测Survivin RRMl、ERCCl、 BRCAl药物耐药预测蛋白的表达,探讨其在宣威地区与云南其他地区肺腺癌中表达可能存在的不同,并比较其与年龄、性别、临床分期之间的关系。2.针对位于SurvivinmRNA232~251bp处的序列,合成反义寡核苷酸(ASODN)和正义寡核苷酸(SODN),构建SurvivinASODN并利用脂质体将其转染到宣威肺腺癌XWLC-05细胞中。MTT法检测SurvivinASODN转染对XWLC-05生长的影响,流式细胞仪测定ASODN转染后对宣威肺腺癌细胞XWLC-05凋亡的影响。3.脂质体介导下SurvivinASODN转染到宣威肺腺癌XWLC-05细胞后RT-PCR法检测SurvivinmRNA的表达情况,Westernblot检测Survivin蛋白的改变情况,探讨其时效、量效关系。4.MTT比色法测定SurvivinASODN联合docetaxel对细胞抑制率的影响；流式细胞术进行TUNEL分析docetaxel和SurvivinASODN联用对XWLC-05凋亡的影响5.利用XWLC-05肺癌移植瘤裸鼠动物模型,通过皮下移植瘤内多点注射,观察SurvivinASODN、docetaxel联合SurvivinASODN等各组对裸鼠生长情况的影响及病理学改变。三、结果1.云南地区肺腺癌患者中Survivii、RRMl、ERCCl、BRCA1的表达分别为57.55%(61/106)、76.41%(81/106)、54.72%(58/106)和45.28%(48/106),它们的表达与患者的年龄、性别和临床分期之间没有明显的关系；2.宣威肺腺癌细胞中Survivin、ERCCl、的表达高于云南非宣威肺腺,有统计学意义；而RRMl、 BRCA1表达差异不大,没有统计学意义。3.相同时间(48h)不同浓度浓度SurvivinASODN转染细胞后均可不同程度地诱导宣威肺腺癌细胞XWLC-05存活率降低,细胞的存活率随浓度的增加而降低,相同浓度(600nmol/L)随着时间的增加其抑制作用明显增加。与对照组(Control),脂质体组(Lip组)及和SurvivinSODN组比较差异有显著性。4.不同浓度的SurvivinASODN作用XWLC-05后出现GO/G1期阻滞,细胞凋亡率逐步上升,有明显的量效关系(P<0.01)。但当达到600nmol/L后进一步加大浓度至800nmol/L未见其凋亡率进一步上升(P>0.05)而空脂质体组、正义转染组与正常对照组之间比较无显著差异。5. SurvivinASODN转染细胞后RT-PCR和WesternBlot结果可使SurvivinmRNA和Survivin蛋白的表达强度降低,明显低于Control组、Lip组、SurvivinSODN组。并且呈时间依赖性,随着时间的延长表达强度逐渐降低。6.MTT检测显示SurvivinASODN、docetaxel和SurvivinASODN联合docetaxel均可使抑制宣威肺腺癌细胞XWLC-05生长,增加凋亡。其中SurvivinASODN联合docetaxel生长抑制率、凋亡率可达72.25%、42.36±2.53%高于单独应用SurvivinASODN的32.67%、25.27±1.43%和docetaxel的42.19%、33.32±1.94%,有统计学意义。7.在转移瘤的动物研究中观察到SurvivinASODN组、docetaxel组和SurvivinASODN联合docetaxel组植瘤的体积随着注射后时间的延长,移植瘤生长产生了明显的抑制作用,并呈时间-效应依赖性,其中SurvivinASODN联合docetaxel更为明显。8.通过对移植瘤的病理学检查发现SurvivinASODN组和docetaxel组可使肿瘤产生点灶状,片状坏死；而SurvivinASODN联合docetaxel可使肿瘤坏死更严重,可见大片无结构红染坏死表现。四、结论1.云南地区肺腺癌患者中Survivin、RRM1、ERCC1、BRCA1的表达与患者的年龄、性别和临床分期之间没有明显的关系,其中Survivi、ERCC1表达宣威地区患者中高于云南其他地区患者。2.脂质体介导的SurvivinASODN能够抑制宣威肺腺癌细胞XWLC-05的生长和促进凋亡,其作用和浓度、时间均有一定的关系,一定范围内呈时间、浓度依赖性,时间越长、浓度越高作用越强。3. SurvivinASODN能够抑制宣威肺腺癌细胞XWLC-05中SurvivinunRNA、 Survivin蛋白的表达,呈时间依赖性。4. SurvivinASODN联合docetaxel能够增强docetaxel的敏感性能够抑制XWLC-05的生长,促进其凋亡。5. SurvivinASODN SurvivinASODN联合docetaxel瘤体注射可均可以以显著抑制裸鼠移植瘤的生长,且安全,无不良反应,SurvivinASODN能够增强docetaxel敏感性。