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背景及目的:心力衰竭(Heart failure,HF)一直以来都是心血管病医生在临床中治疗的难题,具有发病率高、再入院高以及死亡率高的特点,严重影响患者的生活质量。近年来,射血分数保留性心力衰竭(Heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)逐渐得到人们的关注,如能在HFpEF阶段将HF加以控制,则能够延缓向射血分数下降性心力衰竭(Heart failure with reduced ejection fraction,HFrEF)发展的进程。HF的发病机制尚不明确,多认为与心室重构和心肌纤维化有关。依伐布雷定(Ivabradine,IVA)是一种窦房结If电流选择性特异性抑制剂,有研究提出IVA能够抑制HF动物模型心肌纤维化,具有逆转心室重构的作用,但其机制鲜有报道。本研究拟通过建立主动脉弓结扎术(Transverse aortic constriction,TAC)模型,模拟HF由HFpEF向HFrEF发展的过程,阐明IVA对压力超负荷导致的心肌纤维化及心室收缩及舒张功能障碍的影响,探讨IVA调控心室成纤维细胞(Ventricular fibroblasts,vFBs)增殖及转分化的分子机制,探讨其对miR-133a及TGF-β/Smad信号通路的作用,为HF心肌纤维化的防治提供新的理论基础。方法:1、将20只8周龄C57BL/6J雄性小鼠,随机分为假手术组(Sham组,n=10)和TAC模型组(TAC组,n=10)。记录术前及术后两组小鼠的体重、心率和鼠尾动脉压力变化。应用超声心动图与血流动力学检查分析术后4周、8周、12周、17周两组小鼠心脏结构和功能变化,应用H-E、Masson染色、天狼星红染色和免疫荧光染色观察心脏结构和心肌纤维化程度,应用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)和免疫蛋白质印迹(Western Blotting)检测miR-133a及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达。应用ELISA检测血浆NT-proBNP水平。2、将TAC术后4周小鼠随机分为TAC-EFp模型组(n=8)、IVA-L组(10mg/kg/d,n=8)、IVA-H组(20mg/kg/d,n=8),TAC术后9周小鼠随机分为TAC-EFr模型组(n=8)、IVA-L组(10mg/kg/d,n=8)、IVA-H组(20mg/kg/d,n=8),给药8周。应用超声心动图与血流动力学检查分析不同组间小鼠心脏结构和功能变化。应用H-E、Masson染色、天狼星红染色和免疫荧光染色观察心脏结构和心肌纤维化程度。应用qRT-PCR和Western Blotting方法检测miR-133a及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达。应用ELISA检测血浆NT-proBNP水平。应用Mapping lab和Langendorff心脏离体灌流技术检测心室电传导速度、传导方向、传导异质性和室性心动过速(Ventricular tachycardia,VT)诱发率。3、提取和培养新生SD大鼠vFBs,运用AngⅡ建立vFBs转分化模型,并分别给予IVA低剂量和高剂量干预,应用qPCR、Western Blotting和CCK-8法测定TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达和细胞增值率。4、通过脂质体转染方法在vFBs中分别过表达和沉默miR-133a,运用qRT-PCR方法检测miR-133a的表达水平,运用qRT-PCR和Western blotting方法观察CTGF、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ表达,运用CCK-8方法检测vFBs增殖率。5、通过脂质体转染方法在vFBs中分别过表达和/或沉默miR-133a后,运用AngⅡ建立vFBs转分化模型,再分别给予IVA低剂量和高剂量干预,运用qRT-PCR和Western blotting方法观察CTGF、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ表达。结果:1、TAC组小鼠术后4周DBP、IVSTd、LVPWd、IVRT、EDT、LVEDP和Tau明显升高,LVIDs、E/A及-dp/dtmax显著降低(p<0.05);8周HR、SBP明显升高(p<0.05),LVIDs显著性差异消失(p>0.05),LVEF、LVFS、+dp/dtmax无差异性改变(p>0.05);9周LVIDs、LVIDd开始增大(p<0.05),LVEF、LVFS、+dp/dtmax开始降低(p<0.05),NT-proBNP显著升高(p<0.05),与术后时间呈正相关。病理学结果显示TAC组小鼠CVF显著增加(p<0.05),与术后时间呈正相关。随着TAC术后时间的推移,miR-133a表达显著下调,其靶基因CTGF及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达上调(p<0.05)。2、给药8周后,与TAC-EFp组比较,IVA-L组和IVA-H组HR减慢(p<0.05),BP无变化;IVA-H组IVSTd、LVPWd、IVRT、EDT、LVEDP显著降低(p<0.05),EF、FS、-dp/dtmax和+dp/dtmax升高(p<0.05),而IVA-L组差异不明显(p>0.05)IVA-H组和IVA-L组NT-pro BNP、CVF显著降低(p<0.05),miR-133a表达上调,其靶基因CTGF及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达下调(p<0.05)。IVA-H组与IVA-L组间差异不明显(p>0.05)。3、给药8周后,与TAC-EFr组比较,IVA-L组和IVA-H组HR减慢(p<0.05),NT-pro BNP、CVF降低(p<0.05),miR-133a表达上调,其靶基因CTGF及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达下调(p<0.05),BP、IVSTd、LVPWd、LVIDd、LVIDs、EF和FS无变化(p>0.05),IVA-H组IVRT、EDT、E/A、LVEDP和Tau降低(p<0.05),-dp/dtmax和+dp/dtmax加快(p<0.05)。IVA-H组较IVA-L组IVRT、EDT、CVF降低(p<0.05)。电生理结果显示,TAC-EFr组LV传导模式紊乱,传导异质性增加,VT诱发率增高(p<0.05),IVA-H组LV传导模式趋向正常,传导异质性降低,VT诱发率降低(p<0.05);RV传导方向组间差异不明显(p>0.05)。4、Ang Ⅱ组vFBs增殖率升高,miR-133a下调,TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达上调,IVA干预后增殖率下降,miR-133a上调,蛋白表达下调(p<0.05)。5、过表达miR-133a后,vFBs增殖率降低,CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达下调(p<0.05);过表达miR-133a并给予Ang Ⅱ刺激,CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ较Ang Ⅱ组表达下调,较Ad-miR-133a组上调(p<0.05);沉默miR-133a后,细胞增殖率升高,CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达上调(p<0.05);沉默miR-133a并给予Ang Ⅱ刺激,CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达进一步上调(p<0.05)。6、沉默miR-133a并给予Ang Ⅱ刺激和IVA干预,Si-miR-133a+Ang Ⅱ+IVA组较Si-NC+Ang Ⅱ+IVA组CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达显著上调(p<0.05),较Si-miR-133a+Ang Ⅱ组显著下调(p<0.05),与Si-NC+Ang Ⅱ组比较差异不明显(p>0.05)。结论:TAC术后4周小鼠心脏表现为左室肥厚、左室舒张功能障碍以及心肌纤维化,可模拟HFp EF心肌纤维化的病理过程;TAC术后9周小鼠心脏表现为左室肥厚、左室扩大、左室舒张及收缩功能均减退以及心肌纤维化,可模拟HFr EF心肌纤维化的病理过程。If通道抑制剂可通过调控miR-133a和TGF-β/Smad通路发挥抑制心肌纤维化作用,从而改善心室重构,降低VT发生率。对于心功能的改善作用在TAC-EFp组中的治疗效果较TAC-EFr组显著,提示早期干预HF的重要性。