【摘 要】
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逆转录RNA病毒HIV-1,是获得性免疫缺陷综合征——艾滋病的主要病原体,HIV-1感染的肆虐严重威胁着人类生命健康。HIV-1可以利用自身的辅助蛋白劫持宿主细胞内的泛素化系统靶向宿主细胞内的抗病毒因子,使其被泛素化蛋白酶体途径降解,达到逃避宿主免疫杀伤的目的。天然免疫蛋白APOBEC3G（A3G）具有广谱抗病毒作用,为了拮抗A3G的抗病毒活性,HIV-1的病毒辅助蛋白Vif在分子伴侣CBF-β的
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逆转录RNA病毒HIV-1,是获得性免疫缺陷综合征——艾滋病的主要病原体,HIV-1感染的肆虐严重威胁着人类生命健康。HIV-1可以利用自身的辅助蛋白劫持宿主细胞内的泛素化系统靶向宿主细胞内的抗病毒因子,使其被泛素化蛋白酶体途径降解,达到逃避宿主免疫杀伤的目的。天然免疫蛋白APOBEC3G（A3G）具有广谱抗病毒作用,为了拮抗A3G的抗病毒活性,HIV-1的病毒辅助蛋白Vif在分子伴侣CBF-β的作用下招募Cul5-Elo B-Elo C最终形成E3泛素连接酶复合物,将底物A3G泛素化,并使其被蛋白酶体途径降解,进而帮助病毒实现免疫逃脱。蛋白质的泛素化作为一种高度可逆的过程,可以与去泛素化在体内形成动态平衡,是常见的蛋白质翻译后修饰的一种。被认为是病毒感染,肿瘤、神经退行性疾病等许多重大疾病的重要药物靶标。去泛素化酶（DUB）可切割连接的泛素分子之间或泛素与修饰蛋白之间的肽或异肽键,逆转蛋白命运。作为最大的DUB亚家族,USPs主要通过其去泛素酶活性在抗病毒固有免疫反应和病毒触发的凋亡等方面调节病毒感染,USPs在HIV-1感染中的重要作用有待阐明。本研究中,我们探讨了去泛素化酶USP3通过稳定A3G对HIV-1复制的抑制作用及分子机制,主要包括以下内容:1.USP3以胞苷脱氨酶A3G依赖的方式特异性地抑制HIV-1复制。我们的研究发现在有内源A3G的H9细胞系中,USP3可以显著抑制HIV的复制,而在无内源A3G的Jurkat细胞中则病毒复制无明显变化。据此我们推测USP3以A3G依赖的方式特异性地抑制HIV-1复制;在不含有内源性A3G的HEK293T细胞中共转染野生型HIV-1、USP3和A3G,增加USP3表达可以上调A3G的蛋白水平,增强了A3G抗HIV的能力。2.USP3通过拮抗Vif诱导A3G泛素化来稳定A3G。为了探究USP3对于A3G的调节是否与Vif相关,在HEK293T中共转染A3G、Vif及USP3后,Vif诱导的A3G降解明显得到恢复。共转染Vif缺陷的HIV-1以及USP3、A3G和Vif发现USP3过表达上调了A3G蛋白水平,HIV-1病毒量低于对照组。Co-IP结果表明,USP3通过特异性的移除A3G的多聚泛素化来抑制Vif诱导的A3G泛素化及降解,而不是通过破坏Vif与Cul5、Elo B/C和CBF-β之间的相互作用。3.USP3通过酶活依赖和非酶活依赖途径实现对A3G的稳定。为了探究USP3抑制Vif诱导A3G降解是否依赖酶活,本实验构建了锌指结构域ZNF及含有酶活中心的UCH截短体。共转染及IP结果表明:USP3 WT和UCH都可以通过特异性去泛素化A3G来稳定其表达。同时,不具有酶活性中心的ZNF区域也可以稳定A3G的表达,由此猜测USP3促进A3G表达是否有其他非酶活依赖的途径。在表达内源性A3G的Hep G2细胞中,我们还观察到USP3截短体在蛋白水平和m RNA水平都显著增加了A3G的表达。即USP3直接通过稳定A3G m RNA水平来增加A3G的表达。进一步结果表明,USP3特异性地促进了A3家族成员在蛋白质和m RNA水平的表达,而不影响同为宿主限制性因子的SAMHD1和HLTF的蛋白及m RNA水平,即USP3特异性地促进A3蛋白家族的表达。体内IP结果也表明USP3可以与A3G m RNA结合从而稳定A3G的表达。这些结果表明,USP3可能通过调节或剪接A3G m RNA而影响A3G的表达。4.USP3作为抗病毒因子具有广谱性。因为A3G具有广谱抗病毒作用,USP3通过增加A3G的表达能够抑制肠道病毒EV71及CA16的复制。且HIV-1感染者CD4+T细胞中USP3的表达水平与HIV-1感染的进程有关。综上:我们证明了去泛素化酶USP3通过依赖酶活和非依赖的方式稳定A3G表达抑制HIV-1复制,揭示抗病毒因子USP3在宿主与病毒相互作用中的新功能,USP3-A3G去泛素化体系有望成为抗病毒治疗的新靶点。
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