异源四倍体鲫鲤来源于红鲫(carassius auratus redvar.,♀,2n=100)×鲤鱼(cyprinus carpio L.,(?)2n=100)的人工远缘杂交。在杂交子代的F1和F2群体中,杂种子代为可育的二倍体,自F3开始出现异源四倍体杂交子代,并且该异源四倍体鲫鲤群体两性可育,代代相传,目前已经过多代的人工选育(F3-F23),遗传性状稳定,遗传谱系清晰。异源四倍体鲫鲤是通过远缘杂交产生的世界上首例的异源四倍体鱼类,在生产实践以及科学理论研究中都发挥着重要的作用。在生产实践方面,利用雄性四倍体鲫鲤与雌性二倍体红鲫交配产生了用于大规模养殖的不育三倍体湘云鲫2号,产生了巨大的经济效益,同时带动了鱼类杂交遗传育种的进展；而在理论科学研究方面,异源四倍体鲫鲤作为红鲫和鲤鱼的杂交子代,继承了双亲的遗传物质,其染色体数目已从双亲的100条变为200条染色体,另外其在遗传学、细胞学以及进化生物学等方面都产生了一定的遗传变异,已具备了形成一个新物种的前提条件。研究异源四倍体鲫鲤的基因组特征对于分析脊椎动物远缘杂交的遗传机制,远缘杂交过程中杂种的基因组变异,以及杂种的进化命运等生物学现象具有重要的意义。本论文在构建异源四倍体鲫鲤BAC文库的基础上,通过进行14个克隆的全长测序初步分析了异源四倍体鲫鲤的基因组特征(包括GC含量、重复片段比例等),另外通过比较基因组学研究分析了异源四倍体鲫鲤内含子进化的特征,除此之外,本论文通过长PCR技术扩增了红鲫、鲤鱼和四倍体鲫鲤7个同源基因的部分基因序列并从内含子,外显子和整体基因序列的水平进行了比较分析。1.异源四倍体鲫鲤BAC文库的构建本论文初步构建了异源四倍体鲫鲤的BAC文库,该BAC文库共包含阳性克隆31,023个,经NotI酶切检测后克隆的平均片段大小为45.6kb,保存于324个96孔板中,存放于-80℃冰箱中。本实验所构建的BAC文库与其他物种所构建的BAC文库相比插入片段较小,整体覆盖度较低,这可能与四倍体鲫鲤复杂的基因组结构有关(含有双亲两套基因组)。本实验所构建的异源四倍体鲫鲤的BAC文库虽然并不完善,然而其在目前并无四倍体鲫鲤全基因组数据的情况下将对异源四倍体鲫鲤的研究起到至关重要的作用,为后期异源四倍体鲫鲤的全基因组测序奠定了基础,同时也为异源四倍体鲫鲤的功能基因组学以及与亲本红鲫和鲤鱼的比较基因组学研究提供了宝贵的资源。2.BAC克隆全长的测序及分析为了初步观察和探讨异源四倍体鲫鲤的基因组序列特征以及评估其基因组中重复序列的比例,本实验对14个随机挑选的BAC克隆进行了鸟枪法的全长测序,14个BAC克隆的序列长度在17,849bp至87,725bp之间(不含7.8kb的载体序列)。14个BAC克隆的GC含量在34.38%到39.80%之间,平均值为37.10%,这一比例比其父本鲤鱼的GC含量(36.8%)稍高,究其原因可能与异源四倍体鲫鲤高水平的甲基化程度相关。总之,14个BAC全长序列共产生了591,126bp的碱基序列共涵盖了0.02%的异源四倍体鲫鲤的基因组(3.78Gb)。利用在线软件RepeatMasker对测序获得的序列进行了重复序列的分析,14个BAC克隆的全长序列经分析共产生了103,411bp(17.46%)的重复序列。异源四倍体鲫鲤中最丰富的重复元件是反转座子(6.47%),包括长散布元件(LINE)(2.72%),长末端重复序列(LTR)(3.66%)；接着是DNA转座子(4.17%)；另外,预测出105个小RNA重复序列。而在其父本鲤鱼中,DNA转座子的比例为6.67%,而反转座子的比例为4.52%,与异源四倍体鲫鲤相比有较大差异,四倍体鲫鲤中DNA转座子的比例低于其父本鲤鱼,然而在反转座子方面,异源四倍体鲫鲤比其父本稍高。异源四倍体鲫鲤为红鲫和鲤鱼的杂交子代,与其亲本相比发生了大量的基因重组、基因重排以及基因冗余的事件,而新的逆转录因子的插入会破坏基因组的结构,导致一些冗余基因的沉默,进而调控功能基因的有序表达,这可能解释异源四倍体鲫鲤中逆转录因子的比例高于其父本的现象。3.异源四倍体鲫鲤功能基因注释及内含子的分析通过FGENESH软件分析14个BAC克隆所获得的序列,利用BlastX软件与NCBI的NR数据库进行比对,对测序获得的序列进行基因注释,共获得了异源四倍体鲫鲤的11个功能基因(integrator complex subunit7, denticleless homolog, fizzy-related protein homolog, importin-13-like, guanine nucleotide-binding protein G(I))/G(S)/G(O) subunit gamma-5, ADP-ribosylation factor-like14, Iqcal protein, chemokine (C-X-C motif) receptor7b, phosphodiesterase11A,uncharacterized protein LOC101883163, PREDICTED:wu:fk36e11),其中9个基因在其他模式鱼类和含有全基因组序列的鱼类中获得了直系同源基因,将这9个基因结构进行剖析,把外显子序列和内含子序列分开,对内含子的数目和长度进行统计分析,同时利用Malin软件对异源四倍体鲫鲤及斑马鱼,青鱂,河豚,暗纹东方纯,罗非鱼,七鳃鳗,鳕鱼,棘鱼以及人类等物种进行内含子进化的分析,实验结果表明异源四倍体鲫鲤的内含子处于快速的进化过程中伴随着30个内含子的获得以及39个内含子的丢失,与其他硬骨鱼类内含子的进化相比显示出了极大的变异,其他硬骨鱼类中内含子的变化处于相对稳定的状态。基于异源四倍体鲫鲤与其他硬骨鱼类以及七鳃鳗、人类的直系同源基因的比对,我们获得了各个物种所研究基因的内含子长度和数目,在所研究的鱼类中,斑马鱼的平均内含子的长度最长为32,164bp,而异源四倍体鲫鲤的平均内含子长度处于中间值为8,564bp短于斑马鱼、七鳃鳗、鳕鱼但是高于其他硬骨鱼类。在所研究的9个直系同源基因中,平均内含子的密度在9.4到16个之间,七鳃鳗的内含子密度最大为平均每个基因16个内含子,四倍体鲫鲤拥有最低的内含子密度为每个基因中平均含有9.4个内含子。从整体对内含子的分析上来看,异源四倍体鲫鲤群体的内含子出现了极大的变异,其内含子获得和丢失的变化可能与多种因素相关,包括繁殖时间、基因的表达丰度、内含子的相位等等,而本实验我们推论异源四倍体鲫鲤内含子的巨大变化可能与远缘杂交密切相关,红鲫和鲤鱼的远缘杂交导致了其杂交子代异源四倍体鲫鲤内含子的快速进化。4.异源四倍体鲫鲤与亲本同源基因的比较分析利用异源四倍体鲫鲤BAC克隆测序获得的基因序列以及斑马鱼的同源基因序列设计了跨外显子的保守引物,对红鲫和鲤鱼以及四倍体鲫鲤的基因组DNA进行了长片段PCR扩增,获得了红鲫和鲤鱼7个同源基因的大部分基因的序列。分别在外显子,内含子和基因序列的基础上,利用MEGA5软件采用最大似然法构建了系统进化树,结果表明四倍体鲫鲤与其亲本相比即继承了双亲的遗传特征同时又产生了一定的变异；而在整体同源基因序列比对的基础上,通过Clustal w软件对异源四倍体鲫鲤及其亲本的基因序列进行了同源比对,研究结果表明在四倍体鲫鲤中共有两种类型的序列特征,分别是“亲本继承型”和“遗传变异型”,具体可将异源四倍体鲫鲤的基因序列按照这两种类型分为8种子类,其中,importin-13-like基因和fizzy-related protein homolog基因具有与父母本相似度很高的基因序列,为“亲本继承型”,从分子水平证明了四倍体鲫鲤群体继承了父本／母本的遗传物质；另外,像denticleless homolog, guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit gamma-5, chemokine (C-X-C motif) receptor7b以及phosphodiesterase11A基因在四倍体鲫鲤中被证明具有异源重组现象,同时iqcal基因被检测出为异源四倍体鲫鲤特异的基因,其序列和基因结构特征与父母本均不相似且具有较大变异,异源四倍体鲫鲤中异源重组基因和特异基因的序列都属于“遗传变异型”,这些序列从分子水平上证明了异源四倍体鲫鲤群体在进化过程中与其亲本相比产生了很大的遗传变异。综上所述,从异源四倍体鲫鲤的初步基因组特征,内含子进化特征以及与亲本的比较分析结果表明四倍体鲫鲤群体在遗传进化过程中其基因组发生了较大的变异,处于快速进化的过程中,而远缘杂交是导致异源四倍体鲫鲤基因组变异的主要原因。