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目的缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）是在缺氧状态下特异性发挥活性的核转录因子,广泛存在于缺氧条件下的哺乳动物和人体组织细胞内,可以调控许多靶基因的转录,具有多种生物学效应,在许多缺氧性疾病的病理过程中都发挥着重要的作用,因此是针对缺氧的最主要的应答因子之一。HIF-1由α亚基（HIF-1α）和β亚基（HIF-1β）组成。HIF-1α为HIF-1所特有,受氧调节,在功能调控方面起主要作用。HIF-1β又称为芳香烃受体核转运蛋白（arylhydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT）为哺乳动物芳香烃受体复合物的亚基,在细胞浆中稳定表达。在正常氧饱和度下,HIF-1α亚基在翻译后即被泛素-蛋白酶水解复合体迅速降解,半衰期仅为5min,因此细胞中基本检测不到α亚基的表达,而在缺氧状态下,α亚基的降解被抑制,α亚基和β亚基形成有活性的HIF-1,转移到细胞核内调节多种基因的转录。受到HIF-1调节的靶基因多达二百多种,这些基因表达后参与红细胞生成,血管形成,核苷、氨基酸、糖的能量代谢,细胞存活、凋亡和活动以及药物抵抗等生物学效应,以维持组织、细胞在缺氧条件下内环境稳定,以适应缺氧。特别是在生理缺氧状态下,如胚胎发育过程中干细胞的增殖与分化,以及多种病理情况如肿瘤的发展、转移中,HIF-1及其下游基因均发挥着重要作用。正因为HIF-1α亚基在正常氧饱和度下翻译后即被泛素-蛋白酶水解复合体迅速降解,半衰期仅为5min,因此细胞中基本检测不到α亚基的表达。使得关于HIF-1的研究受到极大的限制。本实验采用基因工程技术,体外构建pHIF-1α/EGFP-C2真核细胞表达质粒载体,使得被转染细胞能持续高水平表达HIF-1α。解决了HIF-1α脱离缺氧环境即迅速降解的难题。方法1、细胞培养:应用10%DMEM培养基（含10%FBS、100U/ml青链霉素）培养小鼠胚胎干细胞（D3系）与人肾癌细胞（A498）于37℃,5%CO2的培养箱,每3d换液1次,待细胞沿培养皿底部生长面积达80%-90%时,按常规方法传代。两种细胞分别给予氯化钴（200uM）和3%O2缺氧培养两种诱导方法处理4h、6h、16h。以37℃,5%CO2常规培养的D3小鼠胚胎干细胞组与A498人肾癌细胞作为对照。2、HIF-1αcDNA基因片段提取:提取总mRNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测mRNA完整性。以500ng总mRNA为模板,以Random9引物反转录为cDNA进行RT反应。以此cDNA为模板,PCR扩增目的基因片段。1%琼脂糖凝胶电泳。3、pHIF-1α-T原核细胞扩增载体构建:琼脂糖凝胶回收PCR扩增HIF-1α基因片段,与线性T载体连接。转化DH5α感受态细胞、蓝白筛选、质粒提取均严格按照说明书操作。以SacⅠ酶和ApaⅠ酶进行双酶切37℃,2h,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。以M13-47、RV-M引物,DNA测序。4、pHIF-1α/EGFP真核细胞表达载体构建:（1）HIF-1αcDNA基因片段的制备。（2）pEGFP-C2载体处理。（3）T4 DNA连接酶连接pEGFP-C2载体与HIF-1αcDNA基因片段。转化DH5α感受态细胞。铺含卡娜霉素（100ug/ml）的LB琼脂平板筛选白色菌落,挑取数个菌落扩增后,提取质粒。以SacⅠ酶和ApaⅠ酶进行双酶切37℃,2h,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。以PCR引物,DNA测序。结果1、HIF-1α的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示,仅A498人肾癌细胞缺氧培养组见特异性扩增条带,分子量与理论预期相符,未见非特异扩增杂带。并且随着缺氧时间的延长,HIF-1αmRNA的转录水平逐渐提高。其它组均未见特异性扩增条带。2、pHIF-1α-T扩增载体被双酶切后产生2.6kb与1.7kb两条片段。pHIF-1α-T扩增载体的测序结果表明,DNA序列与Genebank所公布的相关序列（NM 001530）相同,无突变和移码。3、pHIF-1α/EGFP-C2载体酶切后会产生4.7kb与1.7kb两条片段。pHIF-1α/EGFP-C2载体的测序结果表明,DNA序列与Genebank（NM 001530）所公布的相关序列相同,无突变和移码。结论本实验采用缺氧培养A498人肾癌细胞的方法,成功构建了pHIF-1α/EGFP-C2真核细胞表达质粒载体。pHIF-1α/EGFP-C2质粒载体在真核细胞中持续高水平表达HIF-1α,解决了在常氧状态下HIF-1α表达即降解的难题,为进一步研究HIF-1的生物学效应及机制打下基础。