肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的恶性肿瘤,具有早期诊断低、恶性程度高、病程进展迅速、发病率和死亡率极高的特点。据统计,我国肝癌患者占全球肝癌患者一半,且临床数据显示肝癌患者5年的存活率仅有4%。随着医学研究水平的提高和外科治疗手段的进步,肝移植和手术切除目前成为早期肝癌患者的治疗首选,但患者体内可能仍然残留有肝癌细胞,故手术切除后5年的复发率超过70%。大多数肝癌患者在确诊时已是中期或晚期,基本错过了手术切除的时机,而传统化疗药物单独或联合治疗肝癌的疗效均不理想,且毒副作用大,容易引发肝功能障碍,导致患者对化疗的耐受性变差,最终因为不能承受病痛折磨而放弃治疗。对于中晚期肝癌患者最好的保守治疗方法是使用临床靶向药物来抗肿瘤,但是目前我国批准的可用于治疗肝癌的临床靶向药物种类有限,仅有索拉非尼和仑伐替尼两种,且价格昂贵不易获取。因此,寻找价廉、安全且高效的治疗肝癌的药物迫在眉睫。吴茱萸碱(Evodiamine,Evo)是从我国传统中药吴茱萸(evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.)果实中提取出来的一种生物活性碱,是一种天然存在的吲哚生物碱,具有降血压、减肥、镇痛、抗炎、抗肿瘤等特点。前期实验已证实,吴茱萸碱可以通过抑制肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡,有效的控制肿瘤的发展。此外,大量研究还表明,吴茱萸碱可以通过抑制β-catenin介导的血管生成和WWOX信号通路发挥抗HCC作用。但是,吴茱萸碱发挥抗肿瘤的具体机制目前仍不明确。Hippo-YAP信号通路是一条保守的抑癌通路,它具有调节器官大小、抑制细胞增殖和恢复组织再生的功能,也参与预防肿瘤的形成。该信号通路由两个部分组成,其中上游核心分子包括哺乳动物STE20样蛋白激酶1/2(mammalian STE20-like protein kinase 1/2,Mst1/2)和大肿瘤抑制基因1/2(large tumor suppressor 1/2,Lats1/2),下游关键分子包括Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)等。大量研究已证实了YAP在肿瘤细胞中过表达,可以促进细胞的增殖和抑制细胞凋亡。Hippo-YAP信号通路与肝癌细胞高度相关,是参与肝癌形成的一条重要的信号通路。因此,我们提出假设:吴茱萸碱调控肝癌增殖凋亡可能与Hippo-YAP通路相关。目的本文以两种人肝癌细胞株Hep G2和Bel-7402以及Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型为体内外研究对象,观察吴茱萸碱对肝癌细胞增殖、凋亡和Hippo-YAP信号通路的影响,探索吴茱萸碱发挥促进肝癌细胞凋亡的可能病理生理机制,从而为将来肝癌的早期诊断与治疗提供新的思路。方法第一部分:观察吴茱萸碱对两种肝癌细胞株及Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型增殖、凋亡的影响。CCK-8试剂盒检测吴茱萸碱对肝癌细胞增殖的影响,并确定吴茱萸碱对两种肝癌细胞株的IC50值;Ed U染色及克隆形成实验检测吴茱萸碱对肝癌细胞株增殖的影响;流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测吴茱萸碱对肝癌细胞株凋亡和周期的影响;TUNEL染色检测吴茱萸碱对肝癌细胞株凋亡的影响;Western blotting检测吴茱萸碱对肝癌细胞株凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、p53)的影响;构建Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,观察吴茱萸碱对裸鼠体重及肿瘤大小和重量的影响;HE染色观察吴茱萸碱对裸鼠瘤体肿瘤细胞形态的影响;TUNEL实验检测吴茱萸碱对瘤体内肿瘤细胞凋亡的影响。第二部分:观察吴茱萸碱对两种肝癌细胞株Hippo-YAP信号通路的影响:生物信息学IPA(Ingenuity pathway analysis)数据库预测吴茱萸碱、Hippo-YAP信号通路和肝癌三者之间可能存在的直接或间接联系;免疫荧光观察吴茱萸碱对两种肝癌细胞株中YAP和Mst1表达水平的影响;RT-q PCR芯片检测吴茱萸碱对两种肝癌细胞株Hippo-YAP信号通路关键分子表达的影响;Western blotting实验观察吴茱萸碱对两种肝癌细胞株胞质、胞核中YAP水平以及Hippo-YAP信号通路其它关键分子表达的影响。第三部分:验证吴茱萸碱是否是通过Hippo-YAP信号通路影响肝癌的发生发展。使用Hippo-YAP信号通路抑制剂XMU-MP-1预处理两种肝癌细胞株后,采用流式细胞术、细胞克隆形成、Ed U、TUNEL、免疫荧光和Western blotting等技术检测吴茱萸碱对肝癌细胞增殖凋亡以及Hippo-YAP信号通路的影响。结果第一部分:1.CCK-8检测:不同浓度吴茱萸碱(0、0.25、1、4、8、16、32μM)作用于肝癌细胞株Hep G2及Bel-7402后,其生长均明显受到抑制,并具有浓度和时间依赖性(P<0.05)。Hep G2和Bel-7402细胞在48 h的IC50值分别是14.7μM和16μM;2.FCM检测:吴茱萸碱处理两种肝癌细胞株后,细胞凋亡明显增加并呈浓度依赖性,且细胞周期阻滞在G2/M期(P<0.05);3.Ed U染色发现与Control组相比,吴茱萸碱作用细胞后,增殖细胞明显减少(P<0.01);4.克隆形成实验提示随着吴茱萸碱浓度增大,克隆形成逐渐减少,且呈浓度依赖性(P<0.01);5.TUNEL染色:与Control相比,吴茱萸碱处理细胞后,细胞发出明显绿色荧光,而Control组没有绿色荧光,且细胞核完整;6.Western blotting证实与对照组比较,吴茱萸碱处理肝癌细胞后,可以有效的抑制Bcl-2的表达(P<0.05),促使凋亡蛋白Bax及p53的表达增加(P<0.05),且呈浓度依赖性。7.在体外构建的裸鼠皮下移植瘤模型中,我们发现吴茱萸碱灌胃组裸鼠体重与对照组比较没有明显改变(P>0.05),但该组裸鼠瘤体重量和体积大小均明显低于对照组(P<0.05);HE染色显示吴茱萸碱灌胃组瘤体组织出现大片坏死,细胞核固缩及碎裂明显,少见完整的细胞;同时,TUNEL染色发现吴茱萸碱灌胃组存在明显的细胞凋亡。第二部分:1.IPA数据库推测吴茱萸碱对肝癌的生理功能可能是通过YAP蛋白发挥作用的;2.免疫荧光染色证实吴茱萸碱处理肝癌细胞后,YAP表达量明显减少,其中细胞核减少更为明显,但Hippo-YAP信号通路上游关键分子Mst1在细胞质中的表达量明显增多;3.RT-q PCR芯片进一步证实两种肝癌细胞经吴茱萸碱处理后,Mst1均高表达,而YAP均低表达;4.Western blotting实验发现吴茱萸碱处理两种肝癌细胞后,与Contol组相比,YAP蛋白均明显降低(P<0.05),且主要是在细胞核内的表达量减少(P<0.01),此外,Hippo-YAP信号通路中的Mst1/2、Lats1、p-Lats1以及p-YAP的蛋白水平随吴茱萸碱浓度增加而上调(P<0.05),而YAP、CTGF以及Survivin的蛋白表达量则随着吴茱萸碱浓度的增加而降低(P<0.05)。第三部分:1.细胞克隆形成实验和Ed U实验:使用Hippo-YAP信号通路抑制剂XMU-MP-1预处理后,XMU-MP-1+吴茱萸碱组的集落形成和增殖细胞数目明显较吴茱萸碱组增多(P<0.05);2.FCM实验:与吴茱萸碱组相比,XMU-MP-1+吴茱萸碱组G2/M期细胞比例较吴茱萸碱组明显降低(P<0.05),且发生凋亡的细胞明显较吴茱萸碱组减少(P<0.05);3.TUNEL染色实验:XMU-MP-1+吴茱萸碱组的凋亡细胞数目明显较吴茱萸碱组减少;4.Western blotting实验:与吴茱萸碱组相比,XMU-MP-1+吴茱萸碱组细胞Bcl-2蛋白表达明显增多(P<0.05),而Bax以及p53的蛋白表达明显减少(P<0.05)。此外,与Control组相比,吴茱萸碱组肝癌细胞的Hippo-YAP信号通路中Mst1/2、Lats1、p-Lats1、p-YAP的蛋白水平均明显增加(P<0.05),而其下游关键分子YAP以及转录因子CTGF、Survivin蛋白表达量均明显减少(P<0.05);但使用XMU-MP-1预处理肝癌细胞后,与吴茱萸碱组相比,Mst1/2、Lats1、p-Lats1以及p-YAP的蛋白水平均明显下调(P<0.05),而YAP、CTGF以及Survivin蛋白的表达量增加(P<0.05);5.免疫荧光染色实验:XMU-MP-1预处理肝癌细胞后,与吴茱萸碱组比较,Mst1荧光强度明显减弱,而YAP荧光增强,且YAP在细胞核内的分布也较吴茱萸碱组增多。结论1.吴茱萸碱可以显著的抑制肝癌细胞株Hep G2及Bel-7402的增殖,并诱导其凋亡;2.YAP在肝癌细胞中高表达,吴茱萸碱处理后,能够促进YAP的磷酸化,并减少YAP在细胞核的表达;3.体内实验证实吴茱萸碱可以抑制肿瘤的形成,并促进肿瘤细胞的凋亡;4.吴茱萸碱可以通过Hippo-YAP信号通路调控肝癌细胞的增殖和凋亡。