研究背景嗜酸性粒细胞（Eos）是哮喘发病机制中最重要的炎症效应细胞。Eos在气道的浸润与活化与哮喘的严重程度及气道高反应性（AHR）的进展相关，IL-5缺陷鼠进一步证实了气道Eos的浸润与粘液分泌、AHR的内在联系。哮喘气道慢性炎症本质为气道Eos的激活与凋亡障碍。诱导气道活化Eos凋亡是治疗哮喘的关键。目前哮喘的急性发作仍需应用全身激素。它可非特异性地作用于所有细胞并抑制皮质轴反应导致全身副作用，这给它的应用带来限制，特别是儿童和青少年哮喘患者的治疗；此外，还有少部分病人是激素抵抗型的。因此，寻找特异性诱导气道活化Eos凋亡的药物仍是全球研究工作者的艰巨任务。细胞表面抗原CD69的发现为这一需求带来了新的希望。CD69于1981年发现，早期被称为AIM、EA-1、LEU-23、MLR-3等，被认为是T细胞的活化标记物，在T细胞活化后1小时即有表达，并可持续至72小时，对T细胞的增殖分化有一定的作用。后来的研究发现CD69可在几乎所有髓系细胞中表达。CD69通常以同源二聚体形式存在，由分子量为225KD的两条多肽链通过不同的糖基化组成。CD69在细胞表面表达均为磷酸化形式，这对它与其它细胞表面的蛋白分子连接很重要。CD69在细胞的生物功能中起着重要的信号传导作用。它可介导细胞的激活及激活后细胞因子的合成。更重要的是，CD69对细胞的凋亡中也有重要作用。体内激活的具有CD69高表达的T细胞体外易于快速自发凋亡，CD69^-／-小鼠腹腔和脾中淋巴细胞存活率增高，凋亡明显减少，脾淋巴细胞在激活后的凋亡明显低于野生型小鼠，并有凋亡信号Caspase-3的活化减少。关于CD69的研究主要为它在T细胞和NK细胞中的表达，对它在Eos表面的表达研究较少，且均为人Eos体外实验的研究。这些研究显示，人外周血Eos在各种不同的细胞刺激因子作用下激活可表达CD69，哮喘患者气道中Eos也可表达CD69。但小鼠Eos活化后是否表达这种分子尚未有研究。本课题分为两部分，第一部分是测定小鼠活化Eos表面CD69的表达。利用IL-5高分泌转基因小鼠，观察体外不同的细胞刺激因子作用下小鼠Eos表面CD69的表达及哮喘小鼠体内外周血、气道Eos中CD69的表达。第二部分则为观察抗CD69单克隆抗体（antiCD69mAb）对哮喘小鼠抗原激发后气道AHR与炎症的作用，并与哮喘小鼠在激发前后应用地塞米松（DXM）的作用相比较，为哮喘急性发作的治疗提供新的思路。研究目的利用IL-5高分泌转基因小鼠外周血中有大量Eos的特点，提纯其外周血Eos，观察在细胞刺激因子PMA+MA的作用下Eos表面CD69表达的动态变化，以及不同的细胞因子对此表达的影响；以确立CD69是否可以作为小鼠Eos活化的表面标记分子。同时，利用成熟的哮喘小鼠模型，观察antiCD69mAb对抗原致敏激发诱导的小鼠气道反应性和炎症的作用，与DXM的作用相比较，通过BALF中细胞因子水平测定探讨两者对炎症抑制的作用机制。研究方法1．采集IL-5高分泌转基因小鼠外周血，利用磁珠分离系统阴性选择提纯外周血中Eos。以PMA+MA刺激提纯的Eos，检测在1h，12h，18h，24h不同时刻Eos表面CD69的表达及细胞的存活率，设空白培养液培养的Eos为对照组。检测不同的细胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ、GM-CSF、IL-12、IL-13培养18小时后Eos表面CD69的表达及细胞的存活率。同时观察哮喘小鼠外周血和BALF中Eos表面CD69的表达。2．利用成熟哮喘小鼠模型，在OVA激发后腹腔注射antiCD69mAb观察它对哮喘的气道高反应性和气道炎症的抑制作用，并与OVA激发前、后腹腔注射DXM对哮喘的抑制作用相比较，检测小鼠BALF中IL-5、GM-CSF、CRP的水平来探讨两者对哮喘气道病理生理变化的影响机制。研究结果1．CD69在Eos中的表达1．1 PMA+MA激活后Eos表面CD69表达与细胞存活率的动态变化新鲜提纯的Eos表面并无CD69的表达。但在PMA+MA激活后1h Eos表面即有CD69的表达，12h时表达到达高峰，至少持续24小时（p＜0.05）。空白培养液培养的Eos也有同样的变化（p＜0.05）。不同时刻点PMA+MA激活的Eos表面CD69表达显著高于空白培养液中的Eos（p＜0.05）。体外Eos可有自发的细胞凋亡，但PMA+MA激活后Eos的凋亡至明显加速。1．2不同细胞因子作用下Eos表面CD69的表达与细胞的存活率不同细胞因子培养的Eos均有CD69的表达，但只有IFN-γ及GM-CSF、IL-13组显著高于对照组（P＜0.05）。IL-5、GM-CSF可明显提高Eos存活率（p＜0.001），IL-4、IL-12、IFN-γ对Eos表面CD69的表达与Eos的存活率无明显作用。1．3哮喘小鼠外周血、BALF中Eos表面CD69的表达哮喘组小鼠BALF中Eos表面有CD69的表达，但外周血中Eos表面无CD69的表达。2．antiCD69mAb对哮喘小鼠气道高反应性和气道炎症的作用2．1气道反应性测定哮喘模型小鼠对吸入Mch的气道反应性显著高于正常小鼠，抗原激发前应用DXM和抗原激发后应用antiCD69mAb对哮喘小鼠的气道高反应性可完全抑制。而抗原激发后应用DXM仅部分抑制哮喘小鼠的气道高反应性。2．2 BALF中Eos计数抗原致敏激发可诱导小鼠BALF中Eos大量积聚，而正常小鼠BALF中Eos几乎为零。抗原激发前应用DXM和抗原激发后应用antiCD69mAb可完全抑制BALF中Eos的积聚，抗原激发后应用DXM具有同样的作用。2．3肺组织中Eos计数及粘液分泌测定正常小鼠气道内几乎无Eos的积聚和粘液的分泌。而抗原的致敏激发可诱导大量Eos积聚在气道组织和粘液的大量分泌。抗原激发前应用DXM和抗原激发后应用antiCD69mAb均可完全抑制气道中Eos的积聚和粘液的分泌，抗原激发后应用DXM则部分抑制此病理变化。2．4 BALF中的GM-CSF及IL-5、CRP的测定正常小鼠BALF中IL-5无法测出，但GM-CSF、CRP存在一定的基线水平。哮喘小鼠BALF中IL-5水平有明显增高，GM-CSF、CRP水平无改变。抗原激发前应用DXM和抗原激发后应用antiCD69mAb可抑制降低IL-5水平的增高，抗原激发后应用DXM对此无影响。结论1．CD69可作为小鼠Eos的表面活化标记物。它在静息Eos表面不表达，而在活化Eos表面有高度表达。2．CD69在Eos表面的表达与细胞的凋亡密切相关。3．antiCD69mAb可诱导哮喘小鼠气道Eos凋亡，对已形成的气道病理生理有抑制作用。4．抗原激发前应用DXM可有效抑制气道的炎症，但抗原激发后使用DXM仅能部分抑制气道的炎症。