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类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种自身免疫性疾病.以非化脓性增生性滑膜炎为特点，逐渐导致关节软骨的破坏及关节功能的障碍。目前,尚无被证实有导致本病的直接感染因子,但一些细菌、病毒及其代谢产物如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可能通过某些途径影响RA的发病和病情进展。近年来研究显示类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞(Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASF)在RA的发生、发展中发挥着T淋巴细胞依赖途径所不可解释的重要作用,如分泌大量促炎细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶,引发滑膜炎症反应、导致软骨基质的崩解。高迁移率族蛋白1(high mobility group box protein 1, HMGB1)是一种普遍存在于真核细胞中的染色体蛋白。研究发现,HMGB1可于细胞外分泌释放,参与细胞的分化、迁移和再生,并可介导多种炎症和自身免疫性疾病的发生。在RA患者及实验性关节炎动物关节局部HMGB1的表达明显上调,这些异常表达的HMGB1可通过多种分子机制在关节炎发病的多个环节中发挥作用,介导慢性炎症的持续和局部组织的侵蚀破坏。虽然RASF在关节炎中的作用已得到肯定,但目前尚不清楚HMGB1是否能激活RASF产生破坏侵蚀关节软骨的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)及其分子机制。本研究旨在：目的研究HMGB1协同LPS在激活RASF表达MMPs情况,探讨HMGB1协同LPS在激活RASF引起关节损伤的可能途径；初步阐明HMGB1协同LPS激活RASF表达MMPs的分子机制。方法RA患者行滑膜切除术或人工关节置换术时无菌取关节滑膜,分离培养RASF,将培养3-8代RASF用来实验。采用流式细胞仪分析的方法检测RASF给予HMGB1和或LPS刺激后细胞的增殖情况；采用实时定量聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)的方法检测RASF中MMP-1、MMP-3、MMP-13、IL-6等mRNA的表达水平。采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测培养上清液中MMP-3、MMP-13和IL-6浓度；采用western blotting分析细胞内NF-κB和磷酸化1-κB、PI3K和磷酸化P13K、p38MAPK和磷酸化p38MAPK等细胞内信号转导分子表达水平的变化；利用受体阻断性抗体(Anti-TLR2和Anti-TLR4)和竞争性融合蛋白(RAGE-Fc)与HMGB1和或LPS刺激RASF共培养,采用Real-time RT-PCR及ELISA分别检测MMP-1、MMP-3、MMP-13和IL-6等mRNA表达水平及MMP-3、MMP-13和IL-6浓度。结果HMGB1和或LPS激活RASF使其进入S期的细胞明显增多,分别为CON：6.55%；HMGB1: 8.66%; LPS:8.89%; IL-1β:9.02%; HMGB1+LPS:9.60%; HMGB1+IL-1β:9.96%。激活后RASF与对照组相比MMP-3、MMP-13、IL-6等mRNA水平的表达增高,MMP-1mRNA表达水平无明显差异；培养上清液中MMP-3、MMP-13和IL-6浓度增高。利用受体阻断性抗体(Anti-TLR2和Anti-TLR4)和竞争性融合蛋白(RAGE-Fc)阻断HMGB1目前已知的3个受体来研究HMGB1作用的可能途径,结果发现阻断TLR2受体不影响LPS和或HMGB1激活RASF;而阻断LPS受体TLR4后,RASF不被激活,上清中检测IL-6和MMP-3、MMP-13水平与对照组基本一致；Real-time RT-PCR检测也显示MMPs等mRNA表达水平没有明显变化。采用竞争性融合蛋白(RAGE-Fc)阻断高度糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)后,HMGB1和LPS协同刺激RASF的效应减弱了,表现为上清液中IL-6和MMP-3、MMP-13浓度较未阻断组明显下降,Real-time RT-PCR检测也显示。mRNA水平较未阻断组明显下调；采用SB203580特异性抑制MAPK p38磷酸化后,HMGB1与LPS之间的协同激活RASF作用减弱,采用Bay11-7085特异性抑制NF-κB的活化后,则RASF不被HMGB1与LPS激活；采用Western blotting实验进一步证实了上述推测,HMGB1和LPS联合作用于RASF 15min MAPK p38磷酸化水平和NF-κB活化水平显著高于HMGB1或LPS单独作用组,并且用RAGE-Fc融合蛋白预处理可以下调HMGB1和LPS联合作用组MAPK p38和NF-κB蛋白磷酸化水平。结论HMGB1协同LPS激活RASF产生致炎细胞因子和MMPs等导致软骨组织损伤性的酶,并导致细胞生长周期的改变；由于LPS可通过Toll样受体4(Toll-like receptor,TLR4)激活RASF,而RASF表达的TLR4可能同时接受HMGB1和LPS作用。因此,HMGB1可能通过与RASF表面的结合,协同参与LPS的刺激作用；HMGB1是通过结合RAGE增强下游MAPK p38的磷酸化和NF-κB的活化而发挥作用。通过研究HMGB1的胞外作用,探讨其在RASF中产生致炎细胞因子和导致关节破坏的酶的作用和信号转导途径,我们推测,RA时局部异常表达的HMGB1一方面通过激活RASF招募炎性细胞,发挥促炎细胞因子的作用参与局部炎症的启动、放大和维持；另一方面,通过激活RASF参与自身免疫反应,进而参与维持了RA慢性炎症过程,并导致关节组织的侵蚀破坏。通过上述研究,我们有理由相信,通过分子生物学的手段干预HMGB1在RASF中的信号转导的过程有望缓解RA患者关节炎症的发生,抑制骨与软骨破坏,为临床治疗RA带来希望。