目的:理想化的肿瘤治疗是以多学科综合治疗的手段达到延长患者生存时间和改善患者生存质量的目的。鳞状细胞癌是头颈—口腔颌面部最多发恶性肿瘤，目前临床主要是采取以外科手术为主，辅以化、放疗等多种方法的治疗模式，但肿瘤的局部复发和远处转移往往导致治疗失败。在外科术式日臻成熟的今天，头颈—口腔颌面部恶性肿瘤治疗的远期效果即5年期生存率却无明显改善，外科手术不可避免会导致患者不同程度的颜面部缺损、畸形和相应功能障碍、身心创伤。探索其它配合治疗手段有望进一步提升口腔鳞癌的治疗效果。肿瘤是涉及多种基因、多步骤改变的基因疾病，因此，在研究肿瘤发病的分子机制基础上，基因治疗作为对因治疗，是最终征服癌症的希望所在，作为一种新的疾病治疗手段，基因治疗将改变人类疾病治疗的历史进程。 RNA干扰(RNAi)是生物体内抑制特定基因表达的一种现象：当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，在核酸酶Dicer作用下可将长双链RNA降解为21-23bp的小分子干扰RNA(siRNAs)，siRNAs结合其他元件形成RNA诱导沉默复合物(RISCs)，结合并切割mRNA，敲减目的基因的表达，达到基因沉默效果。RNAi具有高度特异性、高效性，相对安全、简便的优势，已经成为研究基因功能的重要工具，并将在临床应用等众多领域取得突破性成果。 恶性肿瘤的一个重要特征是细胞永生化，端粒和端粒酶作为维持染色体的稳定的主要结构和细胞寿命的“生物钟”，特别是端粒酶活性的主要限速性组分：人端粒酶逆转录酶(hTERT)在超过85％以上的恶性肿瘤(包括头颈—口腔颌面部鳞状细胞癌)细胞中特异性的持续表达可视为肿瘤细胞永生化、增殖性增强的关键因素，可望作为肿瘤鉴别诊断、基因治疗的理想靶标。 基因治疗的关键和基础是基因转移，目的基因导入靶细胞并使之表达是其关键环节。基因转移的非病毒学的基因转移方法效率较低，人体实验的基因治疗方案绝大多数是以病毒学方法进行基因转移的。基于人类免疫缺陷症病毒(HIV-1)基础上制备的慢病毒载体已发展成为一种高效、安全的基因载体。慢病毒载体具有诸多优点：转移基因片段容量大、不易诱发宿主免疫反应；不仅能感染分裂细胞，还能用于感染不分裂细胞；可稳定整合于靶细胞的基因组，能在多种组织、器官中介导长期而稳定的转基因表达，治疗基因表达时间可长达六个月之久。慢病毒载体系统经历了10余年4个阶段发展：在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用元件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个独立的质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒；并在包装质粒中删去了HIV-1的所有附属基因；删除了U3区的3LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；去除了tat基因代之以异源启动子序列，这样原始的HIV基因组中的9个基因在制备的HIV慢病毒载体中只保留了3个(gag、pol和rev)；最后加入调控元件形成可诱导基因转导系统。三质粒系统通过共转染包装细胞便能收获只有一次感染能力、而无复制能力、具有自身失活特性的病毒载体颗粒。 目前基因治疗中的另一前沿课题便是实现转基因的可调控性。可调控转基因系统是指在基因表达体系中设计加入特定的诱导剂反应元件，可在外源信号或者药物的诱导下激活，开启或关闭后续目的基因的转录、表达。在利用RNAi进行真核基因功能研究和治疗目的时，多数转基因都是持续表达的，没有表达量和表达时间的调控，这种持续表达不论是在基因功能研究还是基因治疗都存在很大的局限。如果对RNA沉默加以调控，设置开关，就可对选定靶基因的“开”、“关”(on/off)表达状态进行比对研究，从而准确获得靶基因的功能分析。因此可调控、可诱导系统被认为是未来RNAi的重要发展方向。理想化的可调控基因表达系统是目标基因转导后，在外源信号或者药物的诱导下在适当时机开启，按照施与诱导剂的剂量、时间依赖性进行精确的转录和翻译，使其在治疗过程中根据具体情况调节转录、表达剂量，并可在治疗成功或出现毒副作用时随时终止。 本课题组前期应用PAMAM—D纳米载体介导靶向hTERTsiRNA成功转染人舌鳞癌Tca8113细胞获得良好敲减效果，在此基础上，本研究针对hTERT设计5条候选序列，筛选其中有效shRNA序列，制备慢病毒转基因载体，转导人口腔鳞癌细胞系：KB细胞，探索该系统的包装流程、体外转导效率、特异性敲减效能和相关抑瘤机制，并在此基础上制备强力霉素(Doxycycline)诱导可调控慢病毒载体系统，初步研究其对诱导信号的时间、剂量依从性及其对hTERT基因的敲减效能。 本文分以下三部分： 第一部分靶向hTERTRNAi质粒载体的制备与有效靶点筛选的研究； 第二部分靶向hTERT慢病毒载体RNAi系统制备及其治疗口腔鳞癌的研究； 第三部分靶向hTERT可调控慢病毒载体RNAi系统制备及其治疗口腔鳞癌的研究。 得出以下结论： 1.以5—GCAAGTTGCAAAGCATTGGAA—3序列设计的RNAi可有效、特异性地沉默hTERT基因的转录和表达水平。 2.构建外源基因的过表达载体质粒转染工具细胞可作为RNAi敲减效率筛选的验绩标靶。 3.成功制备靶向hTERTRNAi慢病毒载体，病毒滴度：5.0×107TU/ml。该慢病毒转基因系统可有效转染人口腔鳞癌KB细胞株；最佳转导条件MOI为2.5。 4.转导Day5thhTERTmRNA表达水平特异性下降：73.42％，hTERT蛋白表达下调：74.67％；Day10thhTERT蛋白表达下调：82.91％。 5.转导Day5thCyclinD1mRNA表达水平下调：54.67％；Caspase—3上调：100.10％；Caspase—9表达上调：42.67％；细胞凋亡率水平上调206.33％。 6.成功制备调控蛋白KRAB过表达慢病毒载体，并可在293T细胞中有效表达KRAB蛋白。成功制备Tet—ON可调控靶向hTERTRNAi慢病毒载体，病毒滴度：2.5×108TU/ml。 7.KRAB过表达慢病毒载体与Tet—ON可调控靶向hTERTRNAi慢病毒载体按1:1比例(MOI=2.5)共转导KB细胞，hTERT蛋白表达敲减效能与诱导剂强力霉素Dox呈现明显剂量、作用时间依赖性：当未施加Dox诱导表达时，hTERT蛋白表达量仅有微量下调，可能为极低水平的“漏表达”所致；0.1μg/ml—4d、2.0μg/ml-12h可视为本调控系统的诱导剂初始阈值；在诱导剂达到2.0-4.0μg/ml—4d、2.0μg/ml—96h浓度—作用时间范围时基本达到第二阶段非调控慢病毒RNAi系统相应作用时间点的敲减水平(80％)，提示在此诱导剂浓度下，Tet—O/KRAB调控元件在强力霉素作用下解除了tet—R的遏阻，获得完全开放，H1启动子充分启动shRNA的表达，RNAi敲减靶基因效应趋至平台期，达到最高水平。