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第一部分 rBMSCs分泌IL-6改善HIBD大鼠学习记忆功能目的明确大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)来源的IL-6在移植治疗缺氧缺血性脑损伤(HIBD)大鼠中的作用。方法将7日龄SD大鼠通过Rice法结扎左侧颈总动脉,建立HIBD模型,5d后将脑损伤大鼠随机分为HIBD组、HIBD+MSCs组、HIBD+GFP MSCs组和HIBD+si IL-6 MSCs组,后三组大鼠每只经侧脑室注射5μl含2×105个不同处理rBMSCs的细胞悬液,HIBD组注射等体积灭菌PBS。ELISA检测rBMSCs培养上清中IL-6、IL-10、TNFα、IFNβ、IL-8和IL-1β分泌水平。rBMSCs移植2d和9d后取大鼠左侧脑组织通过ELISA检测IL-6水平;移植9d后取大鼠脑组织进行TUNEL染色,检测左侧脑组织细胞凋亡情况;移植3w后行Object-in-place检测各组大鼠对新事物的探索能力,4w后行Morris水迷宫检测大鼠学习记忆功能,6w后通过LTP检测大鼠海马突触可塑性。结果(1)Morris水迷宫检测显示,rBMSCs移植组大鼠在训练过程中找到平台所用时间较HIBD组短,撤去平台后穿越平台区域次数较HIBD组显著增加(P<0.05);而si IL-6 MSCs移植组大鼠在训练过程中找到平台所用时间却较HIBD+GFP MSCs组长,撤去平台后穿越平台区域次数较HIBD+GFP MSCs组明显减少(P<0.05)。(2)Object-in-place检测结果显示,rBMSCs移植组大鼠对新事物的探索能力明显强于HIBD组(P<0.05),但si IL-6 MSCs移植组大鼠对新事物的探索能力却显著弱于HIBD+GFP MSCs组(P<0.05)。(3)LTP检测显示,rBMSCs移植组大鼠海马脑片在高频电刺激后f EPSP(134.2%±4.3%)增加明显多于HIBD组(117.1%±4.6%),而si IL-6 MSCs移植组大鼠海马脑片的f EPSP(131.2%±4.8%)增加幅度明显弱于HIBD+GFP MSCs组(160%±4.5%)。(4)ELISA检测结果显示,rBMSCs分泌的IL-6水平明显高于其他细胞因子(IL-10、TNFα、IFNβ、IL-8和IL-1β)。(5)TUNEL染色分析结果表明,rBMSCs移植组大鼠左侧大脑皮层中凋亡细胞数明显少于HIBD组(P<0.05),但si IL-6 MSCs移植组大鼠左侧大脑皮层中凋亡细胞数却明显多于HIBD+GFP MSCs组(P<0.05)。(6)ELISA检测损伤大鼠左侧脑组织中IL-6水平,发现rBMSCs移植组IL-6水平在移植后2d和9d均显著高于HIBD组(P<0.05),而si IL-6 MSCs移植组大鼠左侧脑组织中IL-6水平却明显低于HIBD+GFP MSCs组(P<0.05)。结论(1)rBMSCs内源性高表达IL-6。(2)rBMSCs移植可改善HIBD大鼠的学习记忆能力和对新事物的探索能力,增强海马突触可塑性;然而沉默rBMSCs中IL-6可减弱rBMSCs对HIBD大鼠学习记忆能力和对新事物探索能力的改善作用,降低海马突触可塑性。(3)rBMSCs移植可增加HIBD大鼠脑组织中IL-6分泌水平,抑制HIBD大鼠脑细胞凋亡;抑制rBMSCs中IL-6分泌水平后,HIBD大鼠脑组织中IL-6分泌水平显著降低,rBMSCs抑制HIBD大鼠脑细胞凋亡作用明显减弱。第二部分 rBMSCs来源IL-6激活神经元STAT3信号通路抑制HIBD所致炎症因子分泌目的探讨rBMSCs来源IL-6在移植治疗HIBD过程中对神经元保护作用的可能机制。方法体外原代培养胎鼠海马神经元,于培养第5d经NSE鉴定其纯度。将培养第5d的原代神经元行OGD损伤,随后再分别与rBMSCs、si IL-6 MSCs及GFP MSCs分离共培养,同时以OGD损伤或未损伤为对照组。第6d提取神经元总RNA,real-time PCR分别检测IL-6R、STAT3、Bax、Bcl-2和SOCS1的m RNA表达水平;Annexin V-FITC/PI双染检测神经元凋亡情况。第7d收集培养上清,ELISA检测上清中IL-6分泌水平;western blot检测IL-6R、STAT3、Bax和Bcl-2的蛋白表达水平。同时分别在rBMSCs移植后2d和9d,提取HIBD、HIBD+MSCs、HIBD+si IL-6 MSCs和HIBD+GFP MSCs四个实验组的大鼠脑组织,ELISA检测左侧脑组织中IFNγ和IP-10的表达水平;并利用免疫荧光双标染色检测rBMSCs移植后9d HIBD+si IL-6 MSCs组及HIBD+GFP MSCs组大鼠左侧脑组织中NSE/Bcl-2共定位表达情况。结果(1)经NSE免疫荧光观察,发现原代胎鼠海马神经元NSE阳性率>90%,纯度满足实验要求。(2)rBMSCs与OGD损伤后的神经元分离共培养后,神经元培养上清中IL-6水平显著增高(P<0.05),IL-6R、STAT3 m RNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);但control、OGD和OGD+MSCs三组神经元中Bax、Bcl-2 m RNA和蛋白表达水平无显著差异,Annexin V-FITC/PI双染也显示上述三组神经元凋亡情况无明显差异。(3)si IL-6 MSCs与OGD损伤后的神经元分离共培养后,神经元培养上清中IL-6水平较对照组明显降低(P<0.05),IL-6R、STAT3 m RNA和蛋白表达水平也较对照组显著下降(P<0.05);但OGD+si IL-6 MSCs和OGD+GFP MSCs两组中Bax、Bcl-2 m RNA和蛋白表达水平无明显差异,两组神经元凋亡情况也无统计学差异。(4)si IL-6 MSCs移植后,HIBD+si IL-6 MSCs和HIBD+GFP MSCs两组大鼠脑组织中NSE/Bcl-2共定位表达亦无明显区别。(5)IL-6/STAT3信号通路PCR array检测结果表明,OGD+si IL-6 MSCs组神经元的IL-6/STAT3信号通路中大部分因子表达水平均较OGD+GFP MSCs组有所下调,其中SOCS1下调约4倍,为下调最明显的因子。(6)real-time PCR检测显示,OGD损伤后的神经元与rBMSCs分离共培养后,神经元中SOCS1 m RNA表达水平明显增高(P<0.05),而与si IL-6 MSCs分离共培养后的神经元中SOCS1的m RNA表达水平较对照组显著降低(P<0.05)。(7)ELISA检测显示,rBMSCs移植2d和9d后,HIBD大鼠左侧脑组织中IFNγ和IP-10表达水平均降低(P<0.05),而si IL-6 MSCs移植组中的IFNγ和IP-10表达水平却较对照组显著升高(P<0.05)。结论(1)成功培养了可用于后续实验的原代胎鼠海马神经元。(2)rBMSCs分离共培养可增加原代海马神经元培养上清中IL-6水平,激活神经元中STAT3信号通路;当沉默rBMSCs中IL-6表达后,si IL-6MSCs分离共培养可降低原代海马神经元培养上清中IL-6水平,抑制神经元中STAT3信号通路;但对神经元凋亡均无显著影响。此结果在HIBD大鼠体内得到进一步验证。(3)rBMSCs来源的IL-6可激活OGD损伤神经元中SOCS1表达水平,抑制HIBD大鼠脑组织中IFNγ和IP-10的分泌。