两种食用菌过氧化物酶和漆酶的生理生化研究及两株黑木耳的DDRT-PCR分析

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通过DEAE-Cellulose、ConA-Sepharose、CM-Cellulose、Q-Sepharose离子交换柱层析及Superdex75凝胶过滤柱层析等研究方法,分别从肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)珊瑚猴头茹(Hericium coralloides)干子实体中分离纯化出过氧化物酶和漆酶两种蛋白质。肺形侧耳过氧化物酶是一个分子量为55kDa的单亚基蛋白,其N-端氨基酸序列为ADNPGDDGN。该酶最适反应温度和最适反应pH值分别为70℃和4.0。但是不能抑制HIV-1逆转录酶的活性与人肝癌细胞株HepG2人乳腺癌细胞株MCF-7的体外增殖。珊瑚猴头菇漆酶是一个分子量为65kDa的单亚基蛋白,其N-端氨基酸序列为(?)(?)VGDDTPQLY。该酶最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和2.2。该酶具有广泛的底物多样性,最适底物为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐,按照催化活性由强到弱依次为:2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐>N,N-二甲基-1,4苯二胺>愈创木酚>联苯三酚。大部分金属离子对该酶活性具有促进作用,Mg2+和Al3+对其酶活性具有明显的促进作用,且作用效果随离子浓度的增大而增强,其活性被Fe2+和Hg2+显著抑制。和以往报道的漆酶蛋白不同的是,该漆酶在浓度达60μM时,也不具抑制人肝癌细胞株HepG2和人乳腺癌细胞株MCF-7的体外增殖的功能。该漆酶可以抑制HIV-1反转录酶的活性,其半抑制浓度为0.06μM。以正常黑木耳(Auricularia auricula-judae)黑A及其退化菌株黑AD为材料,利用mRNA差异显示技术研究二者的基因表达差异,mRNA差异显示3次重复共获得差异条带174条,并克隆了7条差异片段。其中,4个差异片段分别与成熟酶,核迁移蛋白,细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ和聚半乳糖醛酸(内切)酶具有有较高的同源性:3个差异片段属于种未知蛋白或假想蛋白。进一步,克隆了细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ基因并对其分析。本研究结果为进一步进行黑木耳菌株退化的分子机理研究奠定了良好的基础。
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