TGF-β1对静压力作用下PLGA支架上人牙龈成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的影响

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目的:(1)构建PLGA支架复合培养HGFs模型及力学加载模型,研究静压力对HGFs增殖的影响,探讨TGF-β1的表达与HGFs增殖间的关系;(2)研究TGF-β1对静压力作用下HGFs的COL-Ⅰ、MMP-1表达的影响。方法:体外培养HGFs,接种于PLGA支架上,建立PLGA支架复合培养HGFs模型。通过收集上清液检测葡萄糖消耗量和乳酸脱氢酶含量,同时利用CCK-8检测细胞增殖活性,分析三维环境对HGFs生长增殖的影响;利用重力加载装置对HGFs施加静压力,大小为25g/cm2,加载时间分别为6h、24h、48h、72h组,对照组不加力(0h),通过RT-PCR和ELISA技术检测各组HGFs中TGF-β1、COL-Ⅰ和MMP-1表达的变化;并应用TGF-β1抑制剂SB431542,检测静压力作用下TGF-β1对HGFs中COL-Ⅰ和MMP-1mRNA和蛋白表达的影响。结果:(1)采用组织块培养法,经细胞形态学观察及来源鉴定,成功培养HGFs。荧光显微镜显示PLGA支架上有HGFs密集生长。(2)CCK-8结果显示:随着培养时间延长,二维和三维培养的HGFs数量均逐渐增多。第3d二维培养组达最高峰,三维培养组仍处于指数生长期。至第5d三维培养组达最高峰,而二维培养组已出现细胞数量下降(P<0.05)。随后两组细胞生长速度均减慢。(3)葡萄糖消耗量和乳酸脱氢酶含量的检测结果显示:二维培养组第3d时葡萄糖消耗最高,乳酸脱氢酶最低,而三维培养组第5d时葡萄糖消耗最高,乳酸脱氢酶最低,随后两组葡萄糖消耗均缓慢减少,乳酸脱氢酶则开始逐渐升高。(4)CCK-8结果显示:与未加力组相比,在25g/cm2静压力作用下,除6h组外,其余各组差异均有统计学意义(P<0.05),24h组达到各组中最大值。随着加力时间的延长,细胞数量下降。加入抑制剂与不加抑制剂相比,24h组细胞数量明显减少(P<0.05)。(5)RT-PCR和ELISA结果一致,显示:在25g/cm2静压力作用下,随着加力时间延长,TGF-β1、COL-ⅠmRNA和蛋白表达升高,24h达到各组中最大值,随着时间延长表达逐渐下降;而MMP-1mRNA和蛋白表达下降,24h其表达达到最低,随着时间延长表达逐渐升高;抑制TGF-β1后,COL-ⅠmRNA和蛋白的表达均随之下降,MMP-1mRNA和蛋白的表达均随之升高,24h组有统计学差异(P<0.05)。结论:(1)成功构建PLGA支架复合培养HGFs模型。与二维培养相比,HGFs在PLGA支架上可获得更强的细胞生长增殖能力及细胞活性,培养第5d时增殖活性最好。(2)25g/cm2的静压力促进HGFs的增殖,作用24h达到峰值,但随着加力时间延长,这种促细胞增殖的能力受到抑制,HGFs的增殖与TGF-β1的表达呈正相关。(3)25g/cm2的静压力可促进HGFs中TGF-β1、COL-ⅠmRNA和蛋白的表达,抑制MMP-1 mRNA和蛋白的表达,作用24h达到峰值,但随着加力时间延长,这种促表达或抑制能力会减弱。(4)25g/cm2静压力作用下,HGFs中的TGF-β1与COL-Ⅰ、MMP-1的表达有关,且在其表达过程中促进COL-Ⅰ的表达,抑制MMP-1的表达。
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