侵袭性念珠菌病近年来呈不断增加的趋势,其上升速度远超过其他病原体。免疫受损人群深部念珠菌感染的发生率约为11%⁴0%,病死率超过40%。其中,器官移植受者念珠菌感染发病率为20%⁴0%,而艾滋病患者念珠菌感染发病率高达90%。系统性念珠菌感染患者的病死率很高,仅次于血液系统肿瘤患者,是免疫低下患者死亡的主要原因,其一年总生存率很低,一般小于20%。这与艾滋病、糖尿病及恶性肿瘤患者等免疫受损人群的不断增多,广谱抗生素、皮质类固醇、化疗药物的大量应用,器官、骨髓移植,侵入性技术的开展等因素密切相关。现有的治疗深部真菌感染的药物主要包括唑类、多烯类、棘球白素类等,存在种类少、毒副作用大等问题,某些药物的普遍使用所致耐药现象不断增多,一些真菌对现有药物固有耐药,如克柔念珠菌、部分光滑念珠菌等均对氟康唑天然耐药。因此,开发新型高效、低毒的抗真菌药物对于有效治疗真菌感染,挽救患者生命是非常重要的。多金属氧酸盐（Polyoxometalates,POMs,简称多酸）是一类金属-氧簇合物,是由过渡金属与氧原子高度聚合,通过自组装形成的具有空间网络结构的无机化合物,可呈现出许多不同于单核配合物的生物活性。该类化合物作为新型候选药物,具有合成简单、成本低、分子可灵活设计改造、副作用小且理化特性（表面电荷分布、分子形状、酸碱度、溶解性等）优良的优点。迄今报道具有各种药物活性的多酸200余种,主要集中在抗病毒和抗肿瘤方面。多酸抗菌活性研究较少,仅有日本的Yamase小组进行了相关研究,他们发现十钒酸盐可以选择性抑制肺炎链球菌,多钨酸盐同β–内酰胺类抗生素具有协同作用,可提高后者对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性。关于抗真菌的研究则更少,国内开展了少数农业方面的抗真菌研究,国内外尚无多酸抗人类病原真菌的系统研究。本研究的目的是开发新型抗真菌活性多酸。首次选用杂多化合物为研究体系,系统开展了杂多钨酸盐抗念珠菌的药学、体外和体内药效学、细胞毒性和急性毒性研究,并从细胞和分子水平探讨其抗念珠菌作用机制。在药学研究中,根据文献报道的方法合成了杂多钨酸盐α-1,2,3-K₆H[SiW₉V₃O₄₀]（代号为SiW-3）、K₆PV₃W₉O₄₀（代号为PW-6）、α-K₄PVW₁₁O₄₀（代号为PW-8）、K₁₃[Ce(SiW₁₁O₃₉)₂]·17H₂O（代号为SiW-5）、K₁₃[Eu(Si W₁₁O₃₉)₂]·25H₂O（代号为SiW-10）。采用红外光谱、紫外光谱等方法,对受试化合物进行了结构验证和表征。体外抗念珠菌作用研究中,按照美国国家临床试验室标准化委员会（CLSI）颁布的微量稀释法（M27-A方案）,选择6种44株人类病原真菌,进行了体外抗菌药物敏感性筛选,结果表明,5种受试化合物均具有不同程度的抗菌活性。钨硅酸盐SiW-5的抗菌活性最高,MIC范围为<0.2¹0.2μM,对念珠菌属的5个菌种以及新型隐球菌均表现出较好的活性。结合多酸的结构分析,钨酸盐特别是高度负电性的夹心型缺位Keggin结构的钨酸盐,具有更高的抗真菌活性。经体外药效学筛选,选取受试化合物SiW-5开展细胞毒性、急性毒性、体内抗菌作用及其作用机制研究。在细胞毒性实验中,选择人肾上皮细胞系293T作为受试细胞,采用MTS法来初步观察SiW-5对细胞的毒性。25⁸00μM测试范围内的结果表明,24h的细胞抑制率未达到50%,48h的IC₅₀为216.2μM,72h的IC₅₀为99.5μM。可见,SiW-5的IC₅₀剂量远高于其抗真菌的MIC剂量（<0.2¹0.2μM）,证明其对人体细胞的安全性,可以用于进一步的体内抗真菌作用研究。对70只ICR小鼠（雌雄各半）的经口急性毒性评价结果表明,SiW-5的LD₅₀为1651.5 mg/kg,LD₅₀的95%可信限范围为1539.6 mg/kg¹926.5 mg/kg,按WHO急性毒性分级标准,判定其为低毒化合物。体内抗真菌作用研究中,选取76只BALB/c小鼠（雌雄各半）作为实验动物,首先对小鼠进行免疫抑制,以临床最常见病原真菌白色念珠菌为受试菌种,以临床分离的白色念珠菌HL27为感染菌株,成功建立了系统性念珠菌感染小鼠模型,以小鼠一般状态、生存率、肾脏真菌菌落计数、肾脏大体形态以及组织病理学变化等为观察指标,评价SiW-5的疗效。结果表明,SiW-5治疗的小鼠生存率明显提高,生存状态好转,肾脏真菌负担减少,肾脏大体形态观察和PAS病理染色镜检发现真菌浸润减少,说明SiW-5对系统性念珠菌感染具有较好的治疗效果。关于机制研究,本课题组前期已通过细胞硬X射线显微和纳米CT成像技术,证实了杂多钨酸盐Cs₂K₄Na[SiW₉Nb₃O₄₀]·H₂O抗病毒的作用靶位是细胞表面,而非细胞内部。Fukuda N等报道了多金属钨酸盐作用于细菌后,优先定位在细胞膜,从而影响细菌形态及物质运输。因此,本研究推测真菌细胞膜可能是钨硅酸盐SiW-5的作用靶位之一。在本研究的机制探讨中,透射电镜结果显示,经SiW-5作用后,白色念珠菌的细胞膜的确遭到了破坏,多处明显皱缩,导致细胞形态从规则的圆形或卵圆形变成更小的不规则形状,以及内容物的泄露和细胞质内的结构紊乱。麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成部分,它在维持细胞结构完整性、调节细胞膜流动性及细胞代谢循环等生物学功能中起到重要作用。因此,麦角固醇的生物合成是大多数现有抗真菌药物（如氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、两性霉素B、特比萘芬,等等）和新药开发的靶标,药物通过与麦角固醇结合或干扰麦角固醇生物合成通路从而抑制麦角固醇的合成来破坏细胞膜,导致真菌死亡。本研究采用薄层色谱法和高效液相色谱法检测不同药物浓度处理组的念珠菌麦角固醇含量,结果表明,SiW-5对麦角固醇的抑制率随着药物浓度增加而提高,因此推测麦角固醇生物合成的抑制可能是SiW-5抗菌作用的机制之一。为了进一步研究多酸干扰麦角固醇生物合成的分子机制,本研究选择了麦角固醇合成通路上的五个必需基因,进行Real-Time PCR检测。结果表明,除了其中一个基因表达无变化,另外四个基因ERG1、ERG7、ERG11及ERG28的表达水平均有上调。由于前期测得SiW-5对氟康唑耐药菌株也有较好活性,提示其作用于麦角固醇通路上不同于唑类药物的靶点。根据以上研究,我们对SiW-5抑制麦角固醇的可能机理分析如下:（1）SiW-5作用于麦角固醇合成相关基因的转录后水平;（2）SiW-5与合成通路中的一个或几个中间产物固醇成分结合,干扰麦角固醇合成通路;（3）SiW-5直接与终产物麦角固醇结合。本研究首次系统的探讨了杂多化合物对人类病原念珠菌的抗菌活性,通过体外、体内实验,证明了多酸对念珠菌具有抑制作用,且为低毒化合物,并探讨了其抗念珠菌作用机制,为治疗念珠菌感染提供了新的候选药物,并有可能发现不同于现有抗念珠菌药物的新的作用靶点。本研究成果,一方面在多酸抗念珠菌理论上有所突破,丰富了多酸在医药研究领域的应用;另一方面也为开发具有我国自主知识产权的新型高效抗念珠菌药物提供了理论和实验依据。