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胃癌多药耐药(multidrug resistance,MDR)是胃癌化疗失败的主要原因。因此目前肿瘤研究的主要目标就是寻找胃癌MDR的机制。胃癌多药耐药的机制非常复杂,到目前为止尚未完全阐明,包括ABC转运蛋白超家族,micro RNA等都在胃癌多药耐药中起到重要作用。本课题组长期致力于胃癌多药耐药的研究,前期我们主要完成了1)建立了人胃癌细胞系耐药亚型,如SGC7901/ADR,SGC7901/VCR等细胞系;2)利用差异表达分析比较胃癌耐药细胞亚型与亲本细胞差异表达的基因、蛋白及mi RNA,发现了一系列差异分子;3)利用多种分子和细胞生物学分析手段,证明了mi R-15b、mi R-16、Let-7、Pr PC、HIF-1在胃癌细胞MDR中的作用;4)证明了mi R-19a/b通过PTEN途径,促进胃癌细胞MDR。上述研究对深入理解胃癌MDR提供了有益补充。回顾文献与既往研究,我们发现胃癌MDR的发生主要涉及基因表达的调控,尤其是表观遗传学的调控。表观遗传学调控从狭义来说为基因甲基化与组蛋白乙酰化修饰,从广义上来说还包括micro RNA的调控等。其中研究最多、最为透彻的是基因甲基化修饰。已有很多研究报道,表观遗传学调控在肿瘤发生发展中起着重要作用,但是在胃癌MDR中鲜有报道。前期我们利用去甲基化试剂5-aza-dc处理胃癌细胞,发现胃癌细胞的耐药性发生了改变,进一步利用micro RNA芯片观察5-aza-dc对胃癌细胞micro RNA表达谱的影响,发现多个mi RNA的表达发生了改变,其中变化最为显著的是mi R-19a/b。我们利用生物信息学分析软件预测,发现methyl-Cp G-binding protein 2(Me CP2)可能为mi R-19a/b的潜在靶点。Me CP2在基因甲基化状态的维持中起着重要作用。因此,本研究的主要目的是探讨mi R-19a/b-Me CP2调节胃癌细胞多药耐药的作用和机制。【目的】1.明确mi R-19a/b在5-aza-dc诱导胃癌细胞MDR中的作用;2.预测及证明Me CP2是mi R-19a/b的靶分子;3.探索Me CP2在5-aza-dc诱导胃癌细胞MDR中的作用;4.在组织标本中验证mi R-19a/b与Me CP2的关系。【方法】1.在SGC7901中,上调mi R-19a/b的表达,然后借助流式细胞术检测细胞凋亡率MTT法分析IC50值,从而验证课题组前期工作即mi R-19a/b对胃癌细胞MDR的影响;2.利用生物信息学分析软件寻找mi R-19a/b的共同靶分子,通过荧光素酶报告基因及Western blot验证Me CP2是mi R-19a/b的靶分子;3.借助RNAi和过表达载体技术降低及升高Me CP2在胃癌细胞的表达,进而检测Me CP2对胃癌细胞药物敏感性变化的影响;4.利用生物信息学分析软件寻找mi R-19a/b启动子上的Cp G岛;5.利用5-aza-dc刺激胃癌细胞,MTT实验分析胃癌细胞药物敏感性变化,q RT-PCR检测mi R-19a/b的表达变化,Western blot检测Me CP2的表达变化;6.分别转染mi R-19a/b抑制物和Me CP2的si RNA于SGC7901细胞,再用5-aza-dc刺激细胞,MTT法检测胃癌细胞对化疗药物敏感性的变化,q RT-PCR检测mi R-19a/b的表达变化,Western blot检测Me CP2的表达变化;7.利用原位杂交技术和免疫组化技术分析胃癌组织标本中mi R-19a/b及Me CP2的表达,并进行相关性分析。【结果】1.mi R-19a/b介导5-aza-dc在胃癌细胞MDR的调控作用我们利用5-aza-dc处理胃癌细胞SGC7901,MTT实验发现其IC50值升高即胃癌细胞的药物敏感性降低,耐药性增高。利用micro RNA芯片分析经过5-aza-dc处理前后胃癌细胞SGC7901的mi RNA表达谱,发现mi R-19a/b的变化最为显著。q RT-PCR证实了5-aza-dc对mi R-19a/b的表达诱导作用。进一步MTT实验及细胞凋亡实验发现上调mi R-19a/b的表达可以促进胃癌细胞多药耐药,而在胃癌细胞中转染mi R-19a/b抑制物后再用5-aza-dc刺激,与只用5-aza-dc刺激的细胞相比,MTT实验显示其IC50值降低,即抑制mi R-19a/b可以部分抵消5-aza-dc对胃癌细胞MDR的诱导作用。由此提示去甲基化试剂5-aza-dc可以诱导胃癌细胞的多药耐药,而mi R-19a/b至少部分介导了其诱导作用。2.Me CP2为mi R-19a/b的潜在靶分子甲基化Cp G结合蛋白2(methyl-Cp G-binding preotein 2,Me CP2)被多种软件预测为mi R-19a/b的共同靶分子,荧光素酶报告基因及Western blot证实mi R-19a/b可以靶向结合并抑制Me CP2的表达。Western blot结果显示,Me CP2在SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达低于亲本细胞。3.MeCP2介导5-aza-dc在胃癌细胞MDR中的调控作用用5-aza-dc处理胃癌细胞SGC7901后,Western blot显示Me CP2表达降低。而在SGC7901细胞中转染mi R-19a/b的抑制物后再用5-aza-dc刺激,发现抑制mi R-19a/b可以部分抵消5-aza-dc对Me CP2的表达下调作用。接着我们在SGC7901细胞中转染Me CP2过表达载体,MTT实验发现胃癌细胞IC50值降低,即耐药性降低;而转染Me CP2小干扰RNA后,MTT实验发现胃癌细胞IC50值升高,即耐药性升高,以上均提示Me CP2可以逆转胃癌细胞的多药耐药。在SGC7901细胞中转染Me CP2si RNA,与阴性对照组相比,q RT-PCR显示mi R-19a/b表达增高。而在SGC7901细胞转染si RNA,再用5-aza-dc处理细胞,q RT-PCR和MTT实验发现,下调Me CP2表达可以增强5-aza-dc对mi R-19a/b的表达诱导作用和耐药促进作用。提示Me CP2参与了5-aza-dc和mi R-19a/b对胃癌细胞MDR的调控作用。4.mi R-19a/b与Me CP2在胃癌组织中表达负相关利用包含90例胃癌组织及其配对的癌旁组织的组织芯片进行检测。原位杂交分析显示,mi R-19a/b在胃癌组织中的表达高于对应的癌旁组织;免疫组织化学技术检测显示Me CP2在胃癌组织中的表达低于相应癌旁组织。相关性分析结果显示mi R-19a/b与Me CP2的表达存在负相关性(显著性水平均小于0.05)。【结论】基因去甲基化处理可以促进胃癌细胞的MDR表型,mi R-19a/b-Me CP2部分介导了基因甲基化修饰对胃癌MDR的调控作用。因此我们的研究对了解胃癌MDR及寻找逆转MDR治疗的靶点提供了有益补充和依据。