玉米转化酶抑制子cDNA的克隆及功能研究

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玉米不仅是重要的粮食和饲料作物,同时也是重要的工业原料,提高其产量在农业和工业领域均有重要意义。淀粉是玉米的主要贮存物质,因此提高玉米的淀粉含量一直是人们的研究热点。随着分子生物学技术的发展,利用基因工程方法提高玉米淀粉含量,改善玉米品质为人们提供了极大的便利。基因工程技术突破了原来传统常规育种的一些限制,使将外源特异基因引入植物成为可能,解决了远源不亲和的限制:或是特异地干扰植物自身的一些基因,以便于研究某个基因或某个基因家族的具体功能。本研究利用RNA干扰技术,抑制与淀粉合成相关的转化酶抑制子基因表达,提高玉米内源转化酶活性,进而增强分解蔗糖的能力,为淀粉合成或其他器官建成以及营养物质的合成提供充足的原料。   本文研究重点放在淀粉上,主要结果如下:取自交系综31授粉后4-7天的玉米籽粒,提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆转化酶抑制子全长cDNA(INH),将其正反义片段构建在植物表达载体p3301上,使其能特异的干扰玉米内源INH。将构建好的RNA干扰载体转入农杆菌LBA4404中,利用农杆菌浸染法转化玉米幼胚。共浸染综31幼胚约2500个,经4轮PPT(除草剂)加压筛选后获得约150块抗性愈伤,最后获得约200株转基因苗,成活120株。PCR检测成阳性的有45株。通过对转基因玉米T1代PCR检测、RT-PCR分析干扰效果、酶活分析、糖份及淀粉含量测定得到如下结果:转基因株系INH基因的表达较野生型均有不同程度的降低,不同株系干扰效果不同;转基因株系的两种转化酶{与细胞壁结合的转化酶(CWI)和液泡转化酶(SAI)}活性与野生型比较均有不同程度的提高,其中CWI活性最高为野生型的2.5倍;SAI活性最高为野生型的2.3倍。转基因株系的葡萄糖、果糖以及蔗糖含量与野生型比较均有上升,其中葡萄糖含量最高为野生型的1.9倍;果糖含量最高是野生型的2.4倍;蔗糖含量最高是野生型的1.7倍。转基因株系的淀粉含量也比野生型有所上升,最高含量是野生型的3倍。
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