近些年,由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病在许多地区爆发,给农业生产造成了巨大的损失和危害。本文在水稻条纹病毒功能蛋白筛选水稻cDNA文库的基础上,用酵母双杂交和免疫共沉淀技术从分子水平上进一步研究RSV功能蛋白NSvc4与水稻叶绿体蛋白NB2之间,RSV功能蛋白SP与水稻叶绿体蛋白SB16之间的相互作用;以及用荧光定量PCR技术在mRNA水平检测水稻叶片叶绿体NB2基因在病毒侵染前后的表达量变化;同时在RSV外壳蛋白CP能够自身互作的基础上,用酵母双杂交技术进一步确定其自身互作的氨基酸部位。首先为了进一步验证RSV NSvc4蛋白与水稻叶绿体蛋白NB2之间,RSV蛋白SP与水稻叶绿体蛋白SB16之间的相互作用,提取水稻幼嫩叶片总RNA后,通过RT-PCR扩增获得水稻叶绿体基因NB2和SB16全长序列,分别将其连接到酵母双杂交载体pGADT7,构建成重组子pGAD-NB2、pGAD-SB16。将诱饵质粒pGBK-NSvc4、pGBK-SP、pGBK-CP分别与重组子pGAD-NB2及pGAD- SB16共转化酵母菌AH109,并涂布不同营养缺陷型选择性培养基平板,检测RSV NSvc4、SP及CP与叶绿体蛋白NB2、SB16的互作情况。结果表明,水稻叶绿体蛋白NB2能与RSV NSvc4发生互作,而与CP、SP不能互作;水稻叶绿体蛋白SB16均不与NSvc4、CP及SP互作。其次,用免疫共沉淀技术在胞内自然生理条件下进一步验证酵母双杂交实验结果的可靠性。以构建好的酵母表达载体pGAD-NB2、pGAD-SB16为模板,分别扩增获得融合有HA标签的水稻叶绿体NB2、SB16基因,并插入植物表达载体pEGAD载体,构建成重组植物表达载体pEGAD-NB2、pEGAD-SB16,然后将重组植物表达载体和带有c-Myc标签的重组植物表达载体pEGAD-NSvc4、pEGAD-SP分别转化农杆菌EHA105后,农杆菌处理后以不同的组合注射烟草。提取烟草中瞬时表达的蛋白,以HA抗体或c-Myc抗体进行免疫共沉淀实验,最后免疫混合物通过c-Myc抗体或HA抗体进行Western blot检测,确定蛋白的互作情况。免疫沉淀检测结果与酵母双杂交实验结果一致:水稻叶绿体蛋白NB2与RSV NSvc4蛋白存在互作,而与SP,CP之间不存在互作;水稻叶绿体蛋白SB16与RSV SP,CP及NSvc4蛋白均不存在互作。再者,用Real Time PCR技术在mRNA水平上检测水稻NB2基因在RSV侵染前后表达量的差异,从而分析RSV侵染及病毒蛋白与寄主蛋白互作对其mRNA表达情况的影响。结果表明,与健康水稻叶片中的表达量相比,NB2基因mRNA在RSV侵染后的水稻叶片中表现为上调。最后,本文还在RSV外壳蛋白CP能够自身互作的基础上,将CP基因分为N,端1～486 bp、M,端244～726 bp及C,端487～969 bp,用酵母双杂交技术进一步确定其自身互作的活性部位。实验表明,N,端81个氨基酸是水稻条纹病毒CP蛋白自身互作的活性中心。综上所述,通过酵母双杂交和免疫共沉淀技术确定RSV功能蛋白NSvc4和水稻叶绿体蛋白NB2存在互作。经序列分析,NB2基因编码叶绿体有关蛋白,它与RSV NSvc4蛋白的互作让人很容易地联系RSV侵染引起的典型症状;然而这又与NSvc4功能有些不相符。因为先前的研究表明NSvc4似乎只在病毒侵染的早期表达,所以或者先前的研究并不准确,即NSvc4的表达可能会持续相当长的时间或至少能在病毒活跃侵染的位点稳定大量的表达;或者NSvc4可能与病毒的致病并不相关;最近有实验表明NSvc4可能是RSV的运动蛋白,因此NB2蛋白可能在病毒的运动中发挥作用,但目前我们还不清楚其具体的运动机制。利用Real time PCR检测到NB2基因的mRNA水平在健康水稻叶片比RSV侵染后的水稻叶片中较高,NB2为叶绿体亚基结合蛋白CPN-60 beta。因为叶绿体基因组与核基因组有着密切的交流,这种交流使得核基因组能够准确的了解细胞器的工作状态和所处的环境。所以CPN-60 beta mRNA的上调可能与宿主自身的反馈调节有关,即很大一部分CPN-60 beta由于与NSvc4互作而不能发挥作用,这导致叶绿体功能的失调。为了弥补这种缺陷,宿主表达出更多的CPN-60 beta mRNA,从而生成更多的CPN-60 beta蛋白。另外,用酵母双杂交技术确定RSV CP蛋白N,端81个氨基酸是水稻条纹病毒CP蛋白自身互作的活性中心,并且进一步验证这种互作,找到互作关键氨基酸位点及研究这种互作的意义,都将会进一步加深我们对RSV的了解。以上实验结果将为我们进一步明确RSV蛋白的功能,了解RSV的致病机制、寄主对RSV的抗感病作用机理及开发抗病种质资源提供依据。