论文部分内容阅读
大豆(Glycine max (L.) Merr.)是一种重要的经济作物,为人类提供优质蛋白和油脂。然而虫害严重影响了大豆的产量和品质。采用化学农药等措施能够在一定程度上防治病虫害,但无法从根本上解决问题。长期使用农药,不光增加农业成本投入还造成环境的破坏。挖掘优异抗虫基因,鉴定其抗虫功能,探索其作用机制将为大豆分子抗虫育种提供重要的理论依据,对培育优异的抗虫品种具有重要的意义。为探索大豆抗虫相关性状的遗传基础和大豆分子标记辅助选择的应用,本研究通过重组自交系(RIL)群体进行连锁分析,以及利用种质资源组成的自然群体进行关联分析的方法鉴定了大豆对斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)抗性相关QTL。同时,本实验利用生物信息学方法,分离鉴定了大豆CDPK (Calcium-dependent protein kinases)基因家族,对其家族成员在斜纹夜蛾胁迫下的表达模式进行了分析,并克隆GmCDPK1,分别过表达对应的拟南芥突变体和野生型植株进行基因功能验证,进而探讨其作用机制。本研究主要结果如下:1、通过科丰1号和南农1138-2构建的重组自交系(RIL)为材料对虫重(LW)、蛹重(PW)和虫历期(PD)三个抗虫相关性状进行QTL分析。两年田间试验结果显示,184份家系间存在广泛的表型变异,家系间和各年份间显著;3个抗虫性状间均显著相关。利用复合区间作图,本实验在两年数据和BLUP (Best linear unbiased prediction)中共检测到5个QTL,分别分布在2、7、9、10和17号染色体上,其中有3个QTL在两年和BLUP中均被检测到;有1个QTL在2013和BLUP数据中被检测到。有3个QTL临近前人报道的抗虫QTL,另外两个为新检测到QTL。2、以191份栽培大豆为材料,利用1142个SNPs标记对大豆抗虫相关性状(虫重(LW)、蛹重(PW)和虫历期(PD))进行全基因组关联分析。两年试验结果表明:各材料间和年份间显著,实验群体在表型和基因型上均存在广泛的多样性,3个抗虫性状间均显著相关。利用混合线性模型(Q + K),共检测到63个SNPs与抗虫性状关联,其中有3个抗性位点在两年数据中均被检测到与多个抗虫性状显著关联。位于第5号染色体上抗性位点与前人报道抗白粉虱QTL一致,第6号染色体上的位点被报道参与抗生物胁迫,第7号染色体上位点与前人报道抗斜纹夜蛾QTL一致。3、利用生物信息学,借助大豆基因组数据库,在全基因组上鉴定了 39个CDPK基因,.分别命名为GmCPK1～GmCPK39,分别分布在15条染色体上,进化分析表明大豆CDPK基因分为4个亚家族,这与前人在拟南芥和水稻中研究的结果一致.检测大豆CDPK基因在机械损伤胁迫和斜纹夜蛾胁迫处理下的表达模式发现,CPK3和CPK31无论在机械损伤胁迫还是在斜纹夜蛾胁迫处理下,两基因表现相同趋势,均表现为急剧上调,特别是CPK31在机械损伤胁迫和CCW胁迫后,急剧上调表达.4、克隆CPK31基因,并重命名为GmCDPK1,构建GmCDPK1植物过表达载体,转化对应的拟南芥突变体(cpk28)和野生型植株获得转基因拟南芥,通过斜纹夜蛾喂养实验评估其抗虫性。发现GmCDPK1恢复了拟南芥突变体(cpk28)矮小、叶片畸形和花青素积累等表型;同时,与突变体相比过表达植株负调控抗虫性。检测抗虫相关基因表达模式和抗虫相关激素茉莉酸(JA)含量,发现与突变体植株相比,过表达植株恢复了突变体叶片的JA水平;同时抗虫相关基因PDF1.2、VSP2和Thi2.1在拟南芥突变体中显著表达,而JA合成基因AOS和OPR3在突变体和转基因植株中无差异.推测GmCDPK1可能参与JA水平的调控.5、前人研究表明拟南芥突变体cpk28参与活性氧(ROS)的调控.通过在拟南芥突变体cpk28中过表达大豆GmCDPK1,斜纹夜蛾诱导后测量植株叶片ROS,发现转基因植株恢复了突变体ROS的水平.通过亚细胞定位和荧光双分子互补(BiFC)发现,GmCDPK1与RBOHD互作并定位于细胞膜.这些结果表明GmCDPK1作用于膜蛋白,推测可能通过磷酸化RBOHD来参与调控植物体内ROS的水平。综合第四、第五小标题,我们得出GmCDPK1,一方面通过负调节植物体内JA来参与调控植物的生长发育,同时通过调节JA活性来调控植物抗虫性;另外一方面我们发现GmCDPK1与RBOHD互作并定位于细胞膜,推测GmCDPK1通过磷酸化RBOHD来调节植物体内ROS的水平来参与植物的防疫应答。