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目的:肝内胆管结石在西方国家少见,在中国却非常常见,因其病变复杂、复发率高而成为较难治愈的一种良性胆道疾病。胆管切开取石或胆道镜下取石、肝切除等治疗方法仅能尽力清除结石,却不能有效预防结石复发。结石复发患者不得不再次接受手术或内镜取石治疗,治疗风险及难度均增加,同时也增加了患者疾病痛苦。因此,研究结石形成机制,探索预防或干预结石形成的有效方法具有重要临床意义。绝大多数肝内胆管结石是以胆红素钙为主要成分的色素性结石。细菌产生的外源性β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase,β-GD)可催化结合胆红素分解成游离胆红素,促使游离胆红素与钙结合形成胆红素钙,沉积后形成胆色素结石。目前研究发现,胆道感染后,胆汁中除了外源性β-GD以外,内源性β-GD也明显增高,亦可促进结合胆红素分解为游离胆红素,进而参与胆色素结石形成。因此,内源性β-GD活性调节机制的研究将有助于我们探索干预肝内胆管结石形成或复发的有效措施。为了研究内源性β-GD调节机制,本课题拟明确LPS是否通过TLR4/NF-κB/c-myc信号偶联刺激人肝内胆管上皮细胞内源性β-葡萄糖醛酸酶表达进而促进肝内胆管结石形成以及找出在此过程中发挥关键作用的lncRNA并探索姜黄素是否通过调控该关键lncRNA而发挥对人肝内胆管上皮细胞内源性β-葡萄糖醛酸酶表达的调控作用。研究方法:首先对肝内胆管结石患者的肝脏组织切片和正常对照肝组织切片进行NF-κB/c-myc信号通路分子和β-葡萄糖醛酸酶的免疫组化染色分析和对LPS诱导人肝内胆管上皮细胞炎症损伤模型作β-葡萄糖醛酸酶和TLR4/NF-KB/c-myc信号通路分子的Western blot检测以验证肝内胆管结石形成是否与β-葡萄糖醛酸酶的高表达和TLR4/NF-κB/c-myc信号通路的活化相关。再利用其明生物基因雷达httβs://www.gcbi.com.cn/gcuser/html/auth/login?source=generadar 在线预测出与TLR4/NF-κB/c-myc炎症通路的三个炎症分子都有相关性的lncRNA以找出与LPS刺激相关的重要lncRNA。对预测得到的lncRNA在蛋白质-RNA互作数据库(PRIDB)进行验证。接着,我们用荧光定量PCR的方法验证所预测的lncRNA在LPS诱导人肝内胆管上皮细胞炎症损伤模型中是否表达上调,而且同时检测所预测的lncRNA在肝内胆管结石患者的肝脏病变胆管组织和正常肝内胆管组织中的表达水平。确定LINC00311为候选的lncRNA之后,就利用siRNA转染的方式将胆管上皮细胞中的LINC00311敲低后再观测LPS所诱导的炎症反应是否减轻,再利用慢病毒感染方式使人肝内胆管上皮细胞稳定过表达LINC00311,Western blot检测观察过表达LINC00311胆管上皮细胞的TLR4、NF-κB、c-myc和β-葡萄糖醛酸酶的表达情况以及用CCK8实验检测稳定过表达细胞的增殖能力;同时还用Western blot检测过表达胆管上皮细胞的上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物α-SMA、vimentin的蛋白水平以明确是否发生上皮间质转化。然后,我们在LINC00311高表达的人肝内胆管上皮细胞加入NF-κB的抑制剂JSH-23(Selleck公司)以阻断NF-κB/c-myc信号通路后再用Western blot检测β-葡萄糖醛酸酶的表达情况以确定目的lncRNA促进胆管上皮细胞的炎症反应主要是通过NF-κB/c-myc信号通路来起作用的。最后,利用姜黄素抑制LPS刺激胆管上皮细胞所引起的炎症反应。我们用荧光定量PCR的方法检测LINC00311在对照组、LPS处理组和姜黄素与LPS同时处理组的胆管上皮细胞中的表达以探索姜黄素对目的lncRNA是否有抑制作用,并且用Western blot检测三组细胞的TLR4、NF-κB、c-myc通路分子和β-葡萄糖醛酸酶的表达情况以探索姜黄素是否通过抑制上述炎症通路的活化来抑制β-葡萄糖醛酸酶的表达。结果:肝内胆管结石患者的肝脏组织中TLR4/NF-κB/c-myc信号通路呈活化状态且β-葡萄糖醛酸酶高表达,在LPS诱导人胆管上皮细胞炎症损伤模型中,也得到了同样的结果(P<0.05)。利用其明生物基因雷达功能预测到LINC00311和LINC00467这两个lncRNA与TLR4/NF-κB/c-myc信号通路的三个分子都相关,接着对预测得到的lncRNA在蛋白质-RNA互作数据库(PRIDB)进行预测,反向预测得到LINC00311可以和NF-κB相互作用。在LPS诱导建立的人胆管上皮细胞炎症损伤模型中,用荧光定量PCR方法证实了 LINC00311与炎症反应相关(P<0.05),且在肝内胆管结石患者的肝组织中也得到了同样的结果(P<0.05)。接着,利用siRNA转染干扰胆管上皮细胞的LINC00311则抑制了 LPS所引起的炎症反应(P<0.05)。而后将LINC00311过表达的慢病毒感染胆管上皮细胞则可直接上调β-葡萄糖醛酸酶和激活TLR4/NF-κB/c-myc信号通路(P<0.05),还可促进上皮间质转化(P<0.05)。过表达LINC00311不能促进HIBEβiC细胞增殖(P>0.05)。当LINC00311过表达的胆管上皮细胞中的NF-κB/c-myc信号通路被阻断,则β-葡萄糖醛酸酶又被下调(P<0.05)。最后,将LPS刺激的人胆管上皮细胞同时用姜黄素处理,发现姜黄素可以抑制LPS所引起的LINC00311的高表达(P<0.05),因而抑制了内源性β-GD的表达和相应的TLR4/NF-κB/c-myc信号通路的活化(P<0.05)。结论:这些结果给我们揭示了与肝内胆管结石发生密切相关的长链非编码RNA-LINC00311并证实了 LINC00311能够能通过激活TLR4/NF-KB/c-myc信号通路上调β-葡萄糖醛酸酶的表达进而发挥促进肝内胆管结石形成的作用。这就提供了一种新型的生物标记物可作为肝内胆管结石的潜在的治疗靶点。中药姜黄素可以通过下调LINC00311,进而抑制TLR4/NF-κB/c-myc信号通路激活,导致β-葡萄糖醛酸酶表达下降,发挥抑制肝内胆管结石形成的作用。