目的　　 构建pAdxsi-GFP-PSMA和pAdxsi-GFP-4-1BBL两种重组腺病毒,将其转染DC构建成DC疫苗,体外实验观察此DC疫苗呈递前列腺特异性膜抗原及活化T细胞的能力是否增强,另用其诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成,观察其对前列腺癌的治疗效果,为下一步应用于体内实验奠定了基础。　　 方法　　 一、PSMA和4-1BBL腺病毒质粒的构建及鉴定　　 用Adxsi系统构建携带PSMA、4-1BBL基因的复制缺陷型腺病毒载体(pAdxsi-GFP-PSMA和pAdxsi-GFP-4-1BBL)并大量制备。TCID50法测定病毒滴度,并用PCR法鉴定两种基因的表达。　　 二、健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)来源的树突状细胞体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定　　 分离健康志愿者外周血PBMC,加入不同细胞因子体外诱导扩增培养DC,培养第5天时分成5组,分别按MOI为50、100、200、300、400加入Ad-GFP,于12,24,48h荧光倒置显微镜下观察同一MOI下绿色荧光蛋白(GFP)的表达;同时在转染48h后流式细胞仪(FCM)检测不同MOI下GFP阳性率,并用PE-7AAD凋亡和坏死试剂盒检测不同MOI下DC细胞的存活情况,摸索最适MOI。　　 三、树突状细胞感染PSMA/4-1BBL基因重组腺病毒后的免疫功能变化　　 分离健康志愿者外周血PBMC,加入不同细胞因子体外诱导扩增培养DC、T,按最适MOI,在DC中加入相应的病毒量,分成五组:Ad-PSMA/4-1BBL共转染DC组、Ad-PSMA-DC组、Ad-4-1BBL-DC组、Ad-GFP-DC组和普通未转染DC组,荧光倒置显微镜观察DC的形态学变化,培养48h后WesternBlotting法鉴定PSMA与4-1BBL基因在DC中的表达,直接免疫荧光法检测未感染DC与腺病毒感染后DC上CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,ELISA试剂盒测定各组DC疫苗培养上清中IL-12分泌量的变化。混合淋巴细胞反应测定不同组DC疫苗对T细胞增殖的影响,另外可确定DC与T细胞共培养的最佳细胞比例。ELISA试剂盒测定不同DC-CTL组培养上清中IFN-γ、IL-10的分泌量。CCK-8法检测不同转染组DC-CTL细胞及CTL细胞分别对三种前列腺癌细胞(LNCap、Du145、22RV)的杀伤活性。　　 结果　　 1、经酶切电泳、测序、PCR法鉴定,证实重组腺病毒载体(pAdxsi-GFP-PSMA和pAdxsi-GFP-4-1BBL)构建正确,插入片段包含PSMA和4-1BBL基因序列,Ad-PSMA滴度为2×10pfu/ml,Ad-4-1BBL滴度为1.2×10pfu/ml。　　 2、同一MOI下转染48h后转染效率最高,另确定最佳MOI为200。　　 3、PSMA和4-IBBL蛋白可以在DC上正常表达,腺病毒感染后不会影响DC的成熟及形态学改变,共转染组DC表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR共刺激分子均上调,明显高于其它DC组;上清液中IL-12分泌水平共转染组(134.29±2.22)pg明显高于单个转染组及未转染组(P＜0.05);DC:T同一比例下,共转染组刺激自体T细胞增殖能力明显高于其他转染组及未转染组(P＜0.05),各组DC疫苗与T细胞共培养时PSMA/4-1BBL-DC-CTL组IFN-γ分泌量最高,达1176.10±14.37pg/2×106cells,IL-10分泌量最低,为75.14±2.01pg/2×106cells,与其他各组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);效靶比为40:1时肿瘤杀伤作用最强,在同一效靶比时PSMA/4-1BBL-DC-CTL对LNCap的杀伤率明显高于对另两种前列腺癌细胞DU145、22RV的杀伤率(P＜0.05),也明显高于其它DC-CTL组的杀伤率(P＜0.05)。　　 结论　　 本实验中成功构建了Ad-GFP-PSMA和Ad-GFP-4-1BBL病毒质粒,体外实验证实Ad-PSMA/4-1BBL高效转染获得的成熟DC不但高分泌IL-12,诱导CTL后能刺激和增强PSMA特异效应细胞对PSMA阳性表达前列腺癌细胞的杀伤作用:两种肿瘤相关抗原感染DC较以单一肿瘤相关抗原能更有效诱导肿瘤特异性CTL。