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拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是中国东南沿海一种广温广盐性海产蟹类,具有重要的经济价值,是我国的传统养殖品种。青蟹双顺反子病毒-1(Mud crab discistrovirus-1,MCDV-1)和青蟹呼肠孤病毒(Mud Crab Reovirus,MCRV)是拟穴青蟹养殖过程中发现的两种重要病原体,具有较强的侵染性,给青蟹养殖业带来了巨大的经济损失。本文利用实时荧光定量PCR检测方法研究了温度对这两种病毒在青蟹体内增殖的影响以及两种病毒在青蟹不同组织中的增殖规律;建立了MCDV-1的原位杂交检测方法并利用该检测方法对MCDV-1在拟穴青蟹体内的分布进行了定位。本研究将拟穴青蟹分别养殖在24℃、27℃、31℃和35℃的玻璃缸中,每个温度均设置人工感染组和自然感染组。人工感染组注射病毒粗提液进行人工感染,自然感染组不进行处理。在攻毒后第0 h、1 h、4 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h和90 h时从各组中抽取5只拟穴青蟹的血淋巴,利用荧光定量PCR检测血淋巴中MCDV-1和MCRV的含量,统计分析后发现:所有温度的人工感染组和自然感染组中的MCDV-1在攻毒后第24 h-36 h时增殖迅速,人工感染组中31℃的MCDV-1增殖速度最快,病毒量最多时可达13107 copies/ng RNA,而其他温度下MCDV-1含量最高只能达到13105 copies/ng RNA,且含量多少依次为35℃>24℃>27℃;自然感染组中所有温度的MCDV-1增殖速度相近且病毒量最多时均只达到13105 copies/ng RNA,病毒量多少依次为27℃>35℃>31℃>24℃。MCRV的波动比较频繁,总体来说,35℃的人工感染组和自然感染组中,MCRV达到峰值的时间点分别在攻毒后的第1 h和第6 h,病毒量最高可达13105 copies/ng RNA,之后开始下降并趋于稳定;人工感染组中,24℃、27℃和31℃增殖规律相似,并在攻毒后第48 h时达到峰值,病毒量可达13105 copies/ng RNA,多少依次为31℃>27℃>24℃;在自然感染组中,27℃的病毒量最高可达13108 copies/ng RNA,31℃的病毒量最高可达13107 copies/ng,24℃的病毒量却只能达到13106 copies/ng RNA。拟穴青蟹的死亡情况统计发现,在人工感染组中,24℃和31℃的拟穴青蟹于攻毒后第12h出现死亡现象,27℃的拟穴青蟹则在第24个小时开始死亡;在12h-72 h之间,死亡率大小依次为31℃>24℃>27℃,72 h后27℃的死亡率赶超另外两个温度组,35℃条件下拟穴青蟹快速死亡的原因不排除是应激的影响,不具有意义;在自然感染组中,出现死亡现象的快慢依次为31℃、27℃和24℃,且在整个试验进程中31℃的死亡率均高于其他三个温度组,35℃的拟穴青蟹没有发生死亡现象。将拟穴青蟹养殖在30℃的玻璃缸中,用相同的方法进行人工感染,在攻毒后的0 h、12 h、24 h、36 h、60 h和90 h,分别从人工感染组和自然感染组中采集拟穴青蟹的鳃、肝胰腺、心脏、神经节、肌肉和血淋巴,然后用荧光定量PCR的方法检测这些组织中两种病毒的含量,结果发现:最初时MCDV-1在鳃中的含量最高,而MCRV则在神经节中的含量最高,随着时间的推移,所有的组织均可以检测到青蟹双顺反子病毒-1和青蟹呼肠孤病毒。在人工感染组中,MCDV-1在不同组织中含量多少依次为鳃>肌肉>神经节>肝胰腺>心脏>血淋巴,而MCRV在不同组织中含量多少则依次为心脏>肝胰腺>神经节>肌肉>鳃>血淋巴;在自然感染组中,第12 h的所有组织中的MCRV增殖迅速,同一时刻却无法检出MCDV-1;而在第36h之后,MCRV的含量保持较低水平,此时MCDV-1则逐渐恢复增殖。综合分析青蟹双顺反子病毒-1和呼肠孤病毒的组织分布以及增殖规律后发现,当MCDV-1增殖迅速时,MCRV的增殖缓慢,反之亦然。根据MCDV-1基因组的保守区核酸序列设计一对引物,通过RT-PCR扩增出一条长约1314 bp的DNA片段,纯化后用地高辛(DIG)标记制成MCDV-1的核酸探针,利用该探针可以特异性的检测到MCDV-1,而与青蟹呼肠孤病毒(MCRV)、鲍肌肉萎缩症病毒(Ab SV)、鲍类疱疹病毒(Ab HV)、白斑综合症病毒(WSSV)、虎纹蛙病毒(TFV)和锦鲤疱疹病毒(KHV)等水生动物常见病毒均无交叉反应;该探针可以检测到8.583107拷贝的病毒基因。另外,以核酸探针为基础建立了MCDV-1的原位杂交检测方法,利用该方法检测青蟹不同组织内的MCDV-1发现,在拟穴青蟹肠道的黏膜肌层、食管的肌层、肝胰腺的导管周围和神经节的神经胶质细胞周围阳性信号较多。