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白血病是一类常见的造血系统恶性疾病,严重危害人类身体健康。目前白血病的治疗还是以化疗、骨髓移植为主,但多数患者只能获得短暂缓解,最终因复发或耐药而死亡。近年来大量研究显示,白血病患者体内存在着一群比例极少的细胞群-白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs)。这些细胞与正常造血干细胞(HSC)相似,具有无限增殖和自我更新能力,在白血病的发生、发展中起着决定性的作用。目前,LSCs被认为是白血病耐药和复发的主要根源。因此,只有清除LSCs才有可能彻底根治白血病。本课题根据急性髓性白血病干细胞表面表达CD123,而造血干细胞表面不表达CD123的特点,设计并构建了能够特异靶向急性髓性白血病干细胞的溶瘤腺病毒Ad.hCMV-sCAR-IL-3-sp-E1A-△E1B-hCMV-IL-24,该病毒通过融合蛋白sCAR-IL-3、Survivin启动子、IL-24三者的协同作用,清除白血病干细胞,达到治愈白血病的目的。本课题立足于肿瘤靶向基因-病毒治疗(Targeting Gene-Virotherapy)的策略,以溶瘤腺病毒为载体,通过改变腺病毒的天然噬性,达到靶向治疗白血病干细胞的目的。主要创新之处有:(1)5型腺病毒的靶向改造:通过溶瘤腺病表达sCAR-IL-3融合蛋白,融合蛋白的一端与腺病毒的fiber相结合,另一端特异的与急性髓性白血病干细胞表面IL-3受体α链(CD123)相结合,从而介导溶瘤腺病毒进入AML干细胞,达到特异性靶向白血病干细胞的目的。(2)利用Survivin启动子控制病毒复制增殖所必需的基因E1A,使腺病毒只能在Survivin阳性表达的白血病干细胞中增殖,而不能在Survivin表达呈阴性的正常细胞中复制,提高溶瘤腺病毒的靶向性和安全性。(3)抗肿瘤基因IL-24具有潜在的“旁观者效应”,能够选择性地抑制多种肿瘤细胞生长并诱导其凋亡,但对正常细胞没有影响。本课题的主要研究方法有:(1)构建包含两个外源表达框(hCMV-sCAR-IL-3和hCMV-IL-24)的穿梭质粒(2)HEK293细胞中通过同源重组包装目的病毒(3)目的病毒的鉴定纯化(4)通过体外细胞存活实验,分析目的病毒的杀伤性和安全性(5)通过凋亡细胞染色实验和蛋白水平的检测,探究目的病毒诱导细胞凋亡的途径实验结果显示,成功构建了靶向AML干细胞的溶瘤腺病毒Ad.hCMV-sCAR-IL-3-sp-E1A-△E1B-hCMV-IL-24,体外细胞实验表明,Ad.hCMV-sCAR-IL-3-sp-E1A-△E1B-hCMV-IL-24能够特异性靶向AML干细胞,并能显著抑制AML干细胞增殖,并诱导其凋亡,且具有较高的安全性。本课题利用溶瘤腺病毒靶向AML干细胞,为白血病的治疗提供了新的思路,并为后期的靶向基因-病毒治疗白血病提供了实验基础。