论文部分内容阅读
肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7是一种重要的新发传染病病原菌。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),还可在5~10%的病例中引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症,严重者可导致死亡。EHEC O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已经成为全球性的公共卫生问题。病原微生物与宿主的相互作用是决定其感染、发病和预后的关键。粘附定植是O157致病前提。紧密粘附素(Intimin)是O157最主要的定植因子,尤其是它的C端1/3部分(Intimin-C)为胞外功能区,与相应受体(转位紧密粘附素受体,translocated intimin receptor,Tir)结合,介导细菌与肠上皮细胞的紧密粘附,是细菌的重要致病因子。Tir是O157细菌本身基因编码的受体蛋白质,通过其Ⅲ型分泌系统最终整合于宿主细胞膜上,行使紧密粘附素受体的功能。解析紧密粘附素(Intimin)的结构以及研究紧密粘附素(Intimin)与转位紧密粘附素受体Tir蛋白的相互作用特点有助深入认识EHEC O157:H7粘附定植的分子机制和致病机理。据此有可能发现更加高效特异的疫苗抗原表位和新的药物作用靶点。基于以上认识,本实验拟克隆表达紧密粘附素(Intimin)及转位紧密粘附素受体Tir蛋白的相互作用功能区,进行晶体培养结构解析与功能验证的相关研究。1.对O157:H7的IntiminC188及转位紧密粘附素受体Tir结合片段(Tir-M)进行基因克隆表达复性纯化,获得有活性高纯度的蛋白。设计引物采用PCR法自O157菌基因组扩增IntiminC188、Tir-M的编码基因eae-c188与tir-m,构建原核表达质粒pET-21a(+)-eaeC188和pET-21a(+)-tir-m,经测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE电泳检测。目的蛋白IntiminC188经包涵体洗涤后复性,再用阴离子交换柱纯化;Tir-M经超声破菌后镍离子亲和纯化,再用阴离子交换柱纯化。结果显示PCR法自O157菌基因组分别扩增出了约600bp和280bp的目的片段;原核表达质粒pET-21a(+)-eaeC188和pET-21a(+)-tir-m经酶切及测序鉴定,所扩增的TirM基因序列与GenBank公布的序列完全一致,而eaeC188基因序列与GenBank的序列相比较有一个碱基的突变,导致表达的蛋白有一个关键氨基酸的突变(intiminN916Y)。更换高保真的pfu DNA polymerase重新扩增目的基因,再次构建克隆。重新构建的克隆经测序正确无误。转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达,PAGE电泳初步测定目的蛋白的分子量与预期一致。破菌后电泳证实目的蛋白IntiminC188及突变体以包涵体形式表达,经包涵体洗涤、复性和阴离子交换柱纯化后目的蛋白纯度>95%;目的蛋白Tir-M以可溶蛋白形式表达,经镍离子亲和纯化与阴离子交换柱纯化后目的蛋白纯度>95%。适合进行蛋白晶体培养和功能研究。2.在获得高纯度intiminC188及突变体intiminN916Y蛋白的基础上,使用Hampton Research (Laguna Nigel, CA, USA)公司的晶体初筛试剂盒crystal screen Kit I和Kit II,气相扩散悬滴法进行初步的结晶条件筛选。对筛选获得质量较好的晶体进行X-线衍射收集衍射数据。分子置换法进行晶体结构解析,并对其结构进行初步分析。结果获得了质量较好的intiminC188及突变体intiminN916Y蛋白晶体和衍射数据,并解析了晶体结构。分析了intiminC188及突变体intiminN916Y蛋白晶体的细微差别,并对intiminC188的晶体结构与分子置换的模型EPEC的intiminC结构(PDB,编号1F00)进行结构重叠比对分析,其结构总体相似,但细节有一定差别。3.在对IntiminC188及突变体和转位紧密粘附素受体Tir的Intimin结合片段(Tir-M或Tir-IBD)进行克隆表达复性纯化的基础上,利用BIACore 3000系统对IntiminC188及突变体与Tir-IBD进行了亲和力与结合动力学的研究。通过比较紧密粘附素突变前后与受体结合的动力学特征改变,证实了916位氨基酸对于紧密粘附素与受体结合的特殊意义。结合紧密粘附素及其突变体的晶体结构分析,916位氨基酸由N变为Y后,紧密粘附素的结合力改变与其晶体结构变化相吻合,从结构和功能的角度能够相互印证。综上所述,本研究采用基因工程技术成功表达IntiminC188及突变体和转位紧密粘附素受体Tir的Intimin结合片段(Tir-M或Tir-IBD),纯化后通过晶体培养X-线衍射技术解析了IntiminC188及突变体的分子结构;利用BIACore 3000系统对IntiminC188及突变体与Tir-IBD进行了亲和力与结合动力学的研究。