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[目的] 利用基因工程技术构建重组腺病毒Ad-FGF21质粒并包装产生腺病毒。研究携带成纤维细胞生长因子-21(fibroblast growth factor-21，FGF21)基因的腺病毒对db/db小鼠糖代谢的调节作用，为糖尿病的基因治疗提供更多研究数据，为相关基因工程药物的开发提供实验依据。 [方法] 利用PCR技术，从pUC-FGF21质粒中克隆出FGF21基因，经XbaⅠ和BglⅡ双酶切，插入穿梭载体pAd-Track-CMV-GFP中，经测序正确后，将构建好的pAdTrack-FGF21经PmeⅠ酶切线性化并经乙醇沉淀法回收，再与BJ5183细菌中含的腺病毒骨架质粒pAdeasy-1-CMV-GFP同源重组，20～24h后挑取较小菌落进行PCR鉴定，再把阳性菌落提质粒并经PacⅠ酶切鉴定，酶切结果为30kb和4.5kb表示重组正确。再将重组正确的菌落提质粒，转入DH5α菌中，再一次经菌落PCR鉴定和PacⅠ单酶切鉴定正确后，将DH5α菌中重组腺病毒Ad-FGF21质粒提质粒并经PacⅠ酶切线性化后采用乙醇沉淀法回收，利用LipofectamineTM2000把回收产物转入HEK-293A细胞，包装产生腺病毒并纯化，用SDS-PAGE和WesternBlotting法检测FGF21蛋白的表达。在3T3-L1前脂肪细胞经过诱导成熟后，加入0.25μmol/L地塞米松，用酶标仪检测细胞的葡萄糖消耗量，验证胰岛素抵抗细胞模型成功后，用经过纯化的携带FGF21基因的腺病毒感染胰岛素抵抗细胞模型，检测其在Ad-FGF21的作用下的葡萄糖消耗量。再将经过纯化的携带FGF21基因的腺病毒注射到2型糖尿病模型的db/db小鼠中并监测其血糖。 [结果] 1.成功从pUC-FGF21质粒中克隆出FGF21基因，将其构建到穿梭载体pAd-Track-CMV-GFP中;菌落PCR鉴定结果为在550bp左右出现条带，阳性菌落提质粒后用XbaⅠ和BglⅡ双酶切，鉴定结果为在9，220bp和约550bp处各有一条亮带（与预期的549bp一致），同时DNA测序结果也证实成功构建了穿梭质粒pAdTrack-FGF21。 2.将测序正确的pAdTrack-FGF21穿梭质粒用PmeⅠ酶切线性化后与BJ5183细菌中含的腺病毒骨架质粒pAdeasy-1-CMV-GFP同源重组，经过双重菌落PCR鉴定:FGF21片段和pAdeasy-1片段的PCR鉴定。FGF21片段鉴定结果为在550bp左右出现条带（与期望值549bp相符），pAdeasy-1片段鉴定结果为在750bp位置出现亮带。再把以上双重菌落鉴定为阳性的质粒经PacⅠ酶切鉴定结果为33kb和4.5kb，证实重组腺病毒Ad-FGF21质粒构建成功。在将腺病毒穿梭质粒和骨架质粒同源重组的实验中，由于长出来的平板同时有穿梭质粒菌和骨架质粒菌的的生长，目前的研究方法都是通过目的片段和PacⅠ酶切联合鉴定的方法确定目的片段挑选阳性重组子，但此方法费时费力，本实验首次创新地使用双重菌落PCR鉴定初步筛出候选阳性重组子，再经过PacⅠ酶切鉴定，大大节省了时间和成本。 3.将鉴定正确的重组腺病毒质粒转入DH5α菌中，FGF21片段的菌落PCR鉴定结果为549bp出现条带，pAdeasy-1片段的菌落PCR鉴定结果为750bp出现条带，PacⅠ酶切鉴定结果为33kb和4.5kb，证实重组腺病毒Ad-FGF21成功转入DH5α菌。 4.重组腺病毒Ad-FGF21质粒经PacⅠ酶切后，用LipofectamineTM2000将其转染HEK293A细胞，24h后于倒置荧光显微镜下观察，可见有零星的绿色荧光，之后荧光量逐渐增多，转染后13天85％出现明显的CPE并有部分细胞飘起，证实重组腺病毒包装成功。 5.第一代重组腺病毒Ad-FGF21小量扩增，得到第二代腺病毒，再用第二代腺病扩增得到第三代腺病毒，并用TCID50标准滴度测定法测得第三代代重组腺病毒的滴度高达3.9×109PFU/mL。 6.将经过试剂盒纯化的第三代重组腺病毒感染HEK293A细胞，提取总蛋白，经SDS-PAGE法分析，表明提取的总蛋白中有约23KDa大小的蛋白表达，与预期的FGF21蛋白大小符合，再经Western Blotting分析证实以上23KDa大小的蛋白能与FGF21抗体特异结合，证实它就是FGF21蛋白。 7.3T3-L1前脂肪细胞经过诱导剂诱导为成熟的3T3-L1脂肪细胞，建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的细胞模型，发现96h是最佳的成模时间。3T3-L1脂肪细胞经纯化的第三代重组腺病毒感染，经过测定得到葡萄糖消耗量的结果表明，对照组(空载Ad)与空白组不存在统计学差异(P＞0.05)，说明腺病毒载体本身对血糖调节没有作用，而实验组(Ad-FGF21)比对照组(空载Ad)有明显的增加葡萄糖消耗的作用(P＜0.05)，说明FGF21有明显降血糖的作用。 8.经过不同日期、不同时间点随机测定db/db小鼠血糖确立db/db小鼠2型糖尿病模型，并将经过纯化的重组腺病毒Ad-F GF21和空载腺病毒Ad通过尾静脉注射到小鼠体内，定期测量血糖。结果看到实验组(Ad-FGF21)相对于对照组(空载Ad)的有明显降低血糖的作用(P＜0.05)，且对血糖的稳定调节至少可达到4天。对照组(空载Ad)与空白组(PBS)没有统计学差异（P＞0.05）， [结论] 1.成功构建穿梭质粒pAdTrack-FGF21，将其与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1同源重组，首次创新地使用双重菌落PCR鉴定联合PacⅠ酶切鉴定筛出Ad-FGF21质粒。 2.用脂质体转染法包装腺病毒，小量扩增获得高滴度的腺病毒。提取的总蛋白经SDS-PAGE法分析，表明提取的总蛋白中有约23KDa大小的蛋白表达，与预期的FGF21蛋白大小符合，再经Western Blotting证实是FGF21蛋白。 3.用地塞米松溶液将诱导为成熟的3T3-L1脂肪细胞并确立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型，发现96h是最佳的成模时间。将Ad-FGF21、Ad分别作用于3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型，并每24h测定其葡萄糖消耗量，发现Ad-FGF21可以增加葡萄糖消耗量（P＜0.05），而Ad对血糖的调节没有作用(P＞0.05)，初步说明Ad-FGF21可以促进细胞对葡萄糖的代谢。 4.通过尾静脉注射法将纯化的Ad-FGF21注射入db/db小鼠，证实了Ad-FGF21相对于空载体Ad有明显的降血糖作用(JP＜0.05)，且对血糖的稳定调节至少可达到14天。而对照组(Ad)与空白组(PBS)没有统计学差异（P＞0.05）。本实验为2型糖尿病的基因治疗提供了实验依据。