论文部分内容阅读
目的：本研究拟通过肾脏缺血再灌注损伤动物模型的研究,探讨骨髓来源的干细胞在急性肾脏损伤修复中的作用,观察骨髓来源的干细胞能否分化为肾脏实质细胞,深化对干细胞可塑性的认识；观察骨髓干细胞是否可以转化为肾祖细胞,明确肾祖细胞的来源；观察粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是否可以有效动员骨髓干细胞进入外周血并向缺血再灌注损伤肾脏归巢,提高1肾脏修复的效能,为急性肾脏损伤的治疗探索新方法。方法：6周龄全身表达绿色荧光蛋白(GFP)的C57BL/6J转基因小鼠提供骨髓,6-8周龄同种无荧光标记的C57BL/6J小鼠20只作为骨髓受体。在接受骨髓移植前,所有受体小鼠接受致死剂量的γ放射线137Cs照射(放射剂量为8.5Gy)照射结束后2小时内静脉注射2×105骨髓单个核细胞。接受骨髓移植5周后,嵌合体小鼠骨髓重建情况经流式细胞仪检测确认。待骨髓重建完毕后(移植后第6周)所有小鼠均结扎左侧肾蒂30min后再开放,建立缺血再灌注动物模型。实验动物分为两组：(1)生理盐水对照组(n=10)：缺血再灌注手术前3天至术后4天,皮下注射生理盐水,0.2ml/d。(2)G-CSF动员组(n=10)：缺血再灌注手术前3天至术后4天,皮下注射人重组粒细胞集落刺激因子200μg/kg/d。动员结束后第1天取外周血通过流式细胞仪检测Sca-1、c-Kit、CD34阳性的干细胞占外周血非红系细胞的比例。缺血损伤再灌注损伤1周后取肾脏标本行HE染色,采用Vyacheslav等的半定量方法评估肾小管损伤程度。观察动员组与对照组肾脏病理损伤程度的差异。用胶原酶将肾脏消化为单个细胞通过对Sca-1、c-Kit、CD34等不同干细胞抗原标志物进行荧光染色,流式细胞仪检测比较两组肾脏中干细胞含量的差异。缺血再灌注损伤4周后通过组织切片荧光组织化学、免疫组织化学等方法观察骨髓来源的干细胞在肾脏内的分化情况,通过统计肾脏血管内皮细胞数量以及骨髓来源的肾祖细胞数量来验证G-CSF动员组与对照组在肾脏损伤修复方面的差异。结果：G-CSF动员后,外周血流式细胞仪检测显示,分别为Sca-1、c-Kit、CD34阳性的三群干细胞占外周血非红系细胞的比例(3.16%±0.11%、3.78%±0.08%、6.09%±0.13%)均高于对照组(1.67%±0.10%、2.19%±0.06%、2.85%±0.14%),差异有统计学意义(P<0.05)。缺血再灌注损伤1周后,肾脏细胞流式细胞仪检测发现,G-CSF动员组的缺血侧肾脏中,骨髓来源并且分别表达Sca-1、c-Kit、CD34的干细胞(GFP和干细胞抗原表达双阳性)的比例(0.86%±0.05%、0.78%±0.11%、0.90%±0.08%)均高于对照组(0.51%±0.06%、0.47%±0.08%、0.43%±0.03%),差异有统计学意义(P<0.05)；同时动员组的缺血侧肾脏中骨髓来源GFP阳性细胞的百分比(13.05%±1.14%)也明显高于对照组(7.75%±0.58%),差异有统计学意义(P<0.05)。缺血再灌注损伤4周后的肾脏组织切片经CD31、SMA、Sca-1免疫荧光染色,可见骨髓来源的干细胞出现在肾小管间隙和肾小球血管簇,并分化为CD31或SMA阳性的肾脏血管内皮细胞,参与损伤后血管新生。在损伤区域的肾小管中出现骨髓来源表达GFP绿色荧光的细胞,骨髓来源的细胞可以分化为肾小管上皮细胞,参与了肾小管损伤的修复。在肾脏间质中还可以观察到GFP和Sca-1双阳性的骨髓来源的肾祖细胞。通过对比G-CSF动员组和对照组的肾脏,发现动员组在缺血缺血再灌注损伤1周后肾小管损伤程度评分分值(1.46±0.05)明显低于对照组(2.32±0.16)差异有统计学意义(P<0.05)。损伤4周后G-CSF动员组的肾脏中表达血管内皮标志CD31的细胞数目(31.30±0.42)高于生理盐水对照组(20.05±0.58)差异有统计学意义(P<0.05)。通过对骨髓来源的肾祖细胞的计数发现G-CSF动员组中GFP与Sca-1双阳性的细胞数(6.00±0.82)多于对照组(3.50±0.58),差异有统计学意义(P<0.05)结论：(1)骨髓来源的干细胞可以参与损伤后肾脏的血管新生、肾小管细胞再生以及肾脏修复；(2)G-CSF可以有效动员骨髓干细胞进入外周血并向缺血肾脏归巢；(3)G-CSF动员可以减轻小鼠缺血肾脏的组织病理学损伤程度；(4)G-CSF动员可以通过促进缺血肾脏内血管新生及骨髓来源的细胞分化为肾祖细胞,提高肾脏修复的效能；(5)骨髓来源的细胞可以分化为肾脏干细胞,即肾祖细胞,证实了部分肾祖细胞可能来源于肾脏以外的推测。