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柑橘碎叶病是威胁柑橘生产的一种重要病毒病害,,由柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus, CTLV)引起,主要为害枳及以其杂种作砧木的柑橘品种,在世界多个国家有发生报道。随着我国柑橘产业的迅猛发展,枳和枳橙砧木的使用比率也随之逐步提高,加之CTLV在我国沿海多个柑橘产区内广泛分布,且在当地品种上潜症带毒,致使CTLV仍给柑橘产业带来一定为害风险问题。种植脱毒苗木是防治CTLV的根本途径,这就需要建立和完善简便快速、灵敏特异的CTLV检测方法。为此,本文通过引物设计、体系优化等研究建立了CTLV的反转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)检测体系；同时,为制备CTLV抗体,本文对CTLV的外壳蛋白(Coat protein, CP)基因进行了克隆及原核表达；利用ASGV抗体对CTLV检测免疫胶体金检测试纸条进行试制。所获得的主要研究结果如下：1、建立了CTLV的RT-LAMP检测体系：通过引物设计,并对镁离子(Mg2+)、引物、dNTPs、甜菜碱、反应时间和反应温度等影响因子进行优化,建立了CTLV的RT-LAMP检测体系。优化后的25μL体系中包含模板1μL,AMV反转录酶2U,Bst DNA聚合酶8U,RNA酶抑制剂6U,终浓度分别为0.5μmol/L的外引物(F3/B3),1μmol/L内引物(BIP/FIP),0.2μmol/L环引物(Loop F/B),6mmol/L MgSO4,1.2mmol/LdNTPs、0.6mmol/L甜菜碱,5×反应缓冲液[100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),50mmol/L KC1,50mmol/L(NH4)2SO4,0.5%Tween-20],反应温度63℃,反应时间1h。特异性检测实验结果显示,柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)、温州蜜柑矮缩病毒(Satsuma dwarf virus,SDV)、柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)、柑橘裂皮病类病毒(.Citrus exocortis viroid, CEVd)、多种类病毒混合样品{包括柑橘曲叶类病毒(Citrus bent leaf viroid, CBLVd)、啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid, HSVd)、柑橘类病毒Ⅲ(Citrus viroid-Ⅲ,CVd-Ⅲ)、柑橘类病毒Ⅳ (Citrus viroid-Ⅳ, CVd-Ⅳ)、柑橘类病毒Ⅴ (Citrus viroid-Ⅴ, CVd-Ⅴ)、柑橘类病毒OS (Citrus viroid-OS, CVd-OS)、柑橘曲叶类病毒低同源株系(Citrus viroid-I low sequence similarity, Vd-I-LSS)}以及空白对照和水均呈阴性反应,仅CTLV样品呈阳性,表明所建RT-LAMP检测体系特异性良好。比较RT-LAMP、一步法RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度,结果显示,RT-LAMP与实时定量RT-PCR灵敏度相似,检测最低RNA模板浓度约为1.22×10-2ng/μL,而一步法RT-PCR检测最低RNA模板浓度约为1.22ng/μL,表明RT-LAMP检测体系比一步法RT-PCR灵敏100倍。2、CTLV的CP基因克隆、原核表达及CTLV的抗体制备：利用特异引物(PrimerF/R)对CTLV侵染样品进行了RT-PCR扩增,扩增产物切胶回收后连接pMD19-T载体并转化大肠杆菌,所获单克隆的测序结果显示,克隆序列的CP区域与已报道的CP序列(GenBank序列号,FJ223212)一致性达100%。利用特异引物(PrimerF1/R1)扩增CP基因,并插入到原核表达载体pET28a(+),构建了重组载体pET-28a-CP并进行测序。测序结果显示,CP基因已插入到重组质粒pET-28a-CP。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。实验结果显示,诱导表达后获得约30kDa的蛋白,符合预期大小。诱导表达的pET28a-CTLV-CP菌液经超声裂菌法回收上清和沉淀后发现,目的蛋白在沉淀和上清中均有表达,但沉淀中表达含量较高,表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在。将纯化CP稀释后与ASGV的抗体进行ELISA检测。结果显示,纯化CP经5000倍稀释后仍与ASGV抗体呈特异阳性反应,进一步证明所表达的蛋白为CTLV的CP,并且具有良好的抗原性。目前己委托浙江大学生物研究所利用此蛋白进行CTLV抗体制备。3、开展了CTLV免疫胶体金检测试纸条的试制：制备了不同直径的胶体金颗粒,探索了ASGV抗体标记条件,并进行了CTLV胶体金免疫层析检测试纸条的试制。实验结果显示,每100mL胶体金溶液中加入0.9mL2%的柠檬酸钠溶液获胶体金溶液质量较好,胶体金颗粒直径约20.3nm,最佳标记pH值为8.2,最佳标记抗体量为每100μL中加0.01mg ASGV抗体,质控点捕获抗体浓度为0.2mg/mL。试纸条完成了初步组装,检测样品可获得稳定质控点颜色变化,但该试纸条需进一步完善。