目的:糖尿病肾脏病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最常见的微血管并发症。DKD的发病机制与氧化应激、炎症反应、易感基因及肾血流动力学改变等多方面因素有关。Brown Lee[1]提出糖尿病及其并发症的统一机制学说,其核心是高糖引发的氧化应激(Oxidative stress,OS)。NADPH氧化酶是催化氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)生成的关键酶,广泛存在于肾血管内皮细胞、肾小球系膜细胞和足细胞,分子生物学研究发现,NADPH氧化酶亚基p47phox第338位上存在G→A突变,这与ROS产生增加及DKD发生、发展密切相关[2]。8-羟基脱氧鸟苷(8-Hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHd G)是DNA氧化损伤的特异指标,因其影响因素少,在体内含量稳定,被公认为评价机体氧化损伤程度的理想标志物[3]。本研究的目的是①通过酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者血清中8-OHd G含量,从而明确氧化应激在糖尿病及其肾脏疾病发生中所起的作用;②通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)联合单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)直接测序法探讨河北地区汉族人群NADPH氧化酶p47phox基因G338A多态性与DKD的发病及其病情程度关系,旨在对DKD的诊断及防治提供分子遗传学的理论依据。方法:依据1999年WHO糖尿病诊断和分型标准,选取本院内分泌科住院的T2DM患者198例,根据尿白蛋白与肌酐比值(尿A/Cr)将患者分为三组,A:单纯T2DM(Simple diabetes,SDM)组70例,其中男43例,女27例,年龄56.20±7.74岁,病程6.02±2.08年;B:微量白蛋白尿组65例,其中男41例,女24例,年龄58.09±9.42岁,病程9.73±4.59年;C:大量白蛋白尿组63例,其中男39例,女24例,年龄57.89±11.17岁,病程10.47±5.21年。正常对照(Normal control,NC)组为同期我院医务人员及常规体检者中健康个体70例,其中男42例,女28例,年龄55.60±10.81岁。入选者均为无亲缘关系河北地区汉族人。正常对照组和试验组性别与年龄匹配。本研究已通过伦理委员会审批,签署知情同意原则后,抽取受试者(禁食12h后)肘静脉血3ml,乙二胺乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝,用于提取基因组DNA;4ml静脉血,分离血清,用于检测各项生化指标和8-OHd G。(1)临床资料收集:包括性别、年龄、病程、身高(cm)、体重(kg)、血压(mm Hg)等,计算体质量指数(Body mass index,BMI)=体重/身高2;(2)血生化指标检查:使用全自动生化仪测定空腹血糖(Fasting plasma glucose,FBG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)及肝肾功能;(3)免疫比浊法测定糖化血红蛋白(Hb A1c)及尿微量白蛋白、肌酐比值(尿A/Cr);(4)酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清8-OHd G水平。(5)p47phox G338A基因多态性的测定:①基因组DNA提取:3ml的2%乙二胺乙酸(EDTA)抗凝血,用血液基因组DNA小量提取试剂盒提取外周血白细胞DNA,然后经紫光分光光度仪测DNA浓度及纯度。②聚合酶链反应(PCR)联合单核苷酸多态性(SNP)直接测序法检测p47phox G338A基因型:以外周血白细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增,用于扩增NADPH p47phox基因的引物序列根据基因文库的目的扩增区,经Primer Premier 5软件设计,然后由上海捷瑞生物工程有限公司合成,引物序列和扩增片段如下:名称引物序列扩增长度NADPHp47phoxF:5’-TCCCAAGTGGTTTGACGG-3 298bpR:5’-CCTCCTCTTTCTGGCTGTG-3 PCR总反应体系25ul,其中含12.5ul PCR Premix,8.5ul灭菌双蒸馏水,上下游引物各1ul,模板DNA 2ul。PCR反应条件:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸40 s,完成30次循环,末次循环后,在72℃充分延伸3 min,4℃冷却10 min。③进行PCR反应产物的纯化,PCR产物纯化试剂盒由上海捷瑞生物工程有限公司提供。④纯化后的PCR产物经SNP测序仪进行测序,测序结果在Genbank数据库中进行比较分析,证实P47phox基因第4外显子G338A多态性有GG、GA、AA三种基因型。(6)统计学处理:应用SPSS 16.0统计软件对结果进行统计学处理,对各组多态位点基因分布进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检测;计量资料进行正态性检验,统计描述以均值±标准差(X±s)表示;组间比较用方差分析;基因型频率和等位基因频率的比较用卡方检验;8-OHd G浓度与其他因素的相关性采用Spearman相关分析法;用多元逐步回归法分析各因素在T2DM肾脏病变发生中各自独立的作用及相对影响大小。结果:①正常对照组与T2DM组的年龄、性别构成比无差异(P>0.05),具有可比性;与正常对照组比较,T2DM组的BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG及LDL-C均明显升高,HDL-C明显降低(P<0.05或P<0.01);与单纯T2DM组相比,DKD两组的病程、SBP、DBP、TC及TG均显著升高,HDL-C明显降低(P<0.05或P<0.01);与微量白蛋白尿组相比,大量白蛋白尿组病程、SBP、DBP明显升高,LDL-C则明显降低(P<0.05),HDL-C则无明显差异(见Fig.1,Table 1)。②单纯T2DM组血清8-OHd G水平(5.02±0.69)较正常对照组(3.03±0.64)明显升高(P<0.05);DKD两组血清8-OHd G水平均明显高于正常对照组和单纯T2DM组(P<0.01),且大量白蛋白尿组(9.33±1.71)较微量白蛋白尿组(7.44±0.97)显著升高(P<0.05)(见Fig.2)。③血清8-OHd G与病程(r=0.264,P=0.001)、SBP(r=0.195,P=0.004)、FBG(r=0.217,P=0.000)、Hb A1c(r=0.198,P=0.005)、TC(r=0.173,P=0.008)、TG(r=0.296,P=0.000)和LDL-C(r=0.187,P=0.007)呈显著正相关,与HDL-C呈显著负相关(r=-0.271,P=0.000)(见Table 2)。④正常对照组、单纯T2DM组、微量白蛋白尿组及大量白蛋白尿组GA+AA基因型频率分别为11.4%、18.6%、32.3%和38.1%,A等位基因频率分别为5.7%、10.0%、17.7%和21.4%。比较各组间的GA+AA基因型和A等位基因频率,单纯T2DM组与正常对照组间无显著性差异;DKD两组该频率均明显高于正常对照组和单纯T2DM组;而DKD两组间该频率无显著性差异(见Fig.6,Table 3)。⑤不同基因型组间年龄、性别、DBP、TC、TG、LDL-C、HDL-C均无显著性差异(P>0.05);与GG型相比,GA+AA型的病程、Hb A1c、FBG、SBP及8-OHd G均明显升高(P<0.05或P<0.01)。GA+AA基因型组中DKD发病率为68.2%,显著高于GG基因型组的41.1%(X2为14.635,P<0.01);GA+AA基因型与GG基因型相比,DKD发生率的危险度OR=3.072,OR值的95%可信区间为(1.705,5.537),即GA+AA基因型患DKD的风险约是GG基因型的3倍(见Fig.7、8,Table 4、5)。⑥多元逐步回归分析显示:病程(β=0.257,P=0.036)、LDL-C(β=0.357,P=0.015)、SBP(β=0.291,P=0.019)、FBG(β=0.285,P=0.022)和8-OHd G(β=0.473,P=0.008)是DKD的独立危险因素,而A等位基因并不是DKD的独立危险因素(见Table 6)。结论:1 T2DM患者体内8-OHd G水平升高,提示T2DM患者体内存在氧化应激。2河北地区汉族T2DM人群存在p47phox G338A基因多态性,A等位基因携带者血清8-OHd G水平较高。3 8-OHd G是DKD发生的独立危险因素,但A等位基因可能不是DKD的易感基因。