保幼激素（Juvenile hormone,JH）和蜕皮激素是昆虫生长发育过程中两大重要调节激素,蜕皮激素负责调控昆虫的变态过程,而保幼激素负责维持昆虫的幼虫状态避免其过早成熟,并促进昆虫的生殖系统发育。JHAMT（Juvenile hormone acid methyltransferase）作为昆虫保幼激素合成的关键酶,是调控昆虫保幼激素生物合成的重要研究靶标。相关研究表明昆虫的JHAMT功能失调对昆虫体内的JH合成水平影响显著,个体水平表现为虫体生长发育迟缓及繁殖力减弱,后代昆虫的数量和质量严重受损。然而目前针对昆虫JHAMT的研究多集中于其表达特征及生理功能等方面,其催化机理方面的研究始终欠缺。晶体学的发展为蛋白酶催化机制的研究提供了新的平台,通过对蛋白酶结构的解析及催化位点的注释,可在原子水平上对蛋白酶的催化机制进行阐释说明。此外,蛋白酶大分子的结构解析也为其特异性抑制\增强小分子的设计研发提供基础。本研究以家蚕为研究对象,旨在揭示昆虫保幼激素合成中的关键催化酶JHAMT的详尽作用机理。并通过蛋白结构结合计算机辅助筛选的方法,设计筛选出一类昆虫JHAMT特异性小分子先导化合物,这类小分子物质可在添加后改变昆虫体内JHAMT的催化活性从而调节昆虫体内保幼激素合成水平,进一步达到调控昆虫生长发育的目的。研究成果主要有以下几点:1.保幼激素酸甲基转移酶JHAMT结合底物的复合体结构解析通过气相扩散法获得共孵育的JHAMT-SAH-MF复合物晶体,该晶体由6个亚基构成。辅因子SAH(S-（5’-adenosyl）-l-homocysteine横位于JHAMT的两亚基之间,而底物小分子MF（（E,E）-famesoate）则位于辅因子上方的漏斗状疏水口袋中。晶体拓扑结构叠合分析:JHAMT诱导辅因子SAH进入底物结合口袋后,引发周围疏水氨基酸的重排,进而形成可供底物进入的漏斗状疏水口袋,底物进入后疏水氨基酸再次发生重排收紧底物结合口袋,促进JHAMT的酶催化进程并且避免底物小分子的溶剂化。2.JHAMT作用位点解析及机理阐释利用氨基酸的定点突变实验结合超高效液相色谱检测,对参与JHAMT催化过程的相关氨基酸残基进行酶活参数测定。通过对比蛋白酶催化过程中的Km、Kcat及Kcat/Km这三类数值的大小来说明不同突变体蛋白与野生型蛋白的酶催速率及催化效率的差异。结果显示:突变体蛋白的酶催化效率均发生不同程度的下降,而Gln14/His114这对氨基酸残基的突变体蛋白酶无转甲基酶活性。家蚕JHAMT3的T15Q回复突变实验说明Gln14的突变是造成家蚕JHAMT同源蛋白JHAMT3、JHAMT4、JHAMT5和JHAMT6甲基转移酶活性丧失的原因之一。JHAMT与底物小分子FA（（E,E）-Famesoic add）的结合力测定揭示了Gln14/His114这对氨基酸残基参与了转甲基的催化中心反应。原子水平上将昆虫的JHAMT催化机理阐释如下:定位于疏水腔内的底物FA,亲水酯质头部朝向Gln14/His114氨基酸残基对,His114上的氨基与底物FA上羰基、Gln14上的氨基与羟基分别以氢键结合,从而将底物FA锚定到一定的位置上。随后,His114竞争夺走底物FA羟基上的H原子,从而使得底物FA其处于一种去质子化状态,进而对临近的甲基供体SAM（S-（5’-Adenosyl）-L-methionine）进行亲核攻击,夺走其甲基基团,随后底物发生酯化,进一步生成产物MF。同时MF也可作为JH的合成前体物质,进一步环氧化生成JH。3.昆虫JHAMT特异的抑制剂小分子筛选基于已解析JHAMT晶体结构,利用薛定谔（Schr（?）dinger）软件进行小分子的抑制剂模拟筛选。通过该软件构建基于蛋白-配体复合物的药效团模型,并结合已解析的催化作用位点对药效团（pharmacophore）进行设定。课题组先后三次从200余万种小分子数据库中筛选出130余种高匹配度小分子,并分别对这些小分子进行了JHAMT的抑制效率检测。我们同步以家蚕、斜纹夜蛾、埃及伊蚊和果蝇作为研究对象,利用超高效液相色谱分别检测了小分子化合物对上述四种外源表达的昆虫JHAMT的抑制效率,并获得了高抑制效率的小分子。后续的个体实验中,进一步筛选出了对果蝇和埃及伊蚊具有致死致残作用小分子,但家蚕和斜纹夜蛾的个体实验未能观察到明显抑制表征。通过家蚕的咽侧体离体培养实验证明:外加的抑制剂小分子能够通过抑制昆虫体内的JHAMT来降低保幼激素的合成水平。推测昆虫的体型大小、生活方式、进食环境及生活史周期长短的差异可能是导致家蚕和斜纹夜蛾的个体抑制剂实验无明显表征的原因。