目的:乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球面临的一项重大公共卫生问题,据WHO估计,全球约有20亿人感染了HBV,有3.6亿人成为慢性乙肝患者。HBV感染者中大约有15-40%的人会发展为肝硬化、肝功能衰竭、肝细胞癌（HCC）。HBV感染、肝硬化是HCC最主要的危险因素,但是从慢性乙型肝炎、肝硬化发展为肝癌需要经过很多年,如果我们能对这些高危人群进行定期监测,早期发现、诊断,就能及时进行治疗,从而延长患者寿命。但是由于现有的诊断技术包括一些血清标志物其早期诊断效果不佳,灵敏度、特异度不高,从而造成了病情的延误,因此需要寻找更为灵敏的,诊断准确度更高的标志物,为临床决策提供帮助。本室前期通过乙肝及其相关疾病蛋白质组学的研究,利用飞行质谱技术,发现一个多肽片段4210Da,在慢性乙肝及其相关疾病不同病程中的含量存在显著性差异。经质谱鉴定,4210Da是真核肽链释放因子eRF3b裂解后的一部分,因此设想eRF3b蛋白在乙肝及其相关疾病中是否也存在差异。由于目前市场上没有eRF3b蛋白含量检测试剂盒,因此本研究自行制备了针对eRF3b氨基端第108-215位氨基酸的兔多克隆抗体和大鼠多克隆抗体,由于这段多肽含有110个氨基酸,因此称其为eRF3b-110,编码eRF3b的基因为GSPT2,eRF3b-110所对应的基因片断记为GSPT2-330。通过双抗体夹心ELISA检测血清中eRF3b的含量,分析eRF3b在乙肝及其相关疾病中的诊断价值,为临床大规模的病例对照研究奠定基础。方法:（1）分子克隆GSPT2-330基因,构建重组质粒。采用胍盐酸法提取基因组DNA,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增获得GSPT2-330。将GSPT2-330基因克隆至pGEX-4t-1载体中,并应用碱裂解法提取质粒,进行重组质粒PCR鉴定及测序分析。（2）融合蛋白的表达、纯化、酶切。对含有pGEX-4t-1-GSPT2-330重组质粒的大肠杆菌DH.5α进行IPTG诱导表达,获得带有GST标签的GST-eRF3b-110融合蛋白,通过10% SDS-PAGE检测融合蛋白表达及可溶性。大量表达GST-eRF3b-110融合蛋白,通过GST Sefinose^TM Resin纯化带有GST标签的GST-eRF3b-110融合蛋白,进行10% SDS-PAGE检测GST-eRF3b-110融合蛋白纯化情况。通过凝血酶在GST Sefinose^TM Resin柱上酶切GST-eRF3b-110融合蛋白,进行18% SDS-PAGE检测GST-eRF3b-110融合蛋白酶切情况。对酶切获得的eRF3b-110蛋白进行质谱鉴定。（3）多克隆抗体的制备和纯化。用酶切后的eRF3b-110作为抗原免疫新西兰大白兔,用GST-eRF3b-110融合蛋白作为抗原免疫Wistar大鼠,制备多克隆抗体。采用间接ELISA法测定抗体效价,并通过western blot检测抗体特异性。采用protein A亲和层析柱进行抗体纯化,纯化后的抗体用间接ELISA进行抗体效价的测定,通过SDS-PAGE分析抗体的纯度,并测定抗体浓度。（4）建立双抗夹心ELISA法,检测病人血清中eRF3b含量。以兔抗人eRF3b多克隆抗体作为包被抗体,以大鼠抗人GST-eRF3b多克隆抗体作为检测抗体,通过方阵滴定法确定最佳试验条件,建立双抗体夹心ELISA体系。测定正常对照、慢性乙肝患者、HBV感染肝硬化患者、HBV感染肝癌患者血清中eRF3b含量。（5）统计学处理。采用SPSS 17.0进行统计分析,对于计量资料而言,正态分布的资料以均数±标准差（x±s）表示;非正态分布资料以中位数（下四分位数,上四分位数）即M（P₂5,P₇5）表示。对于计量资料的比较,如果数据满足独立性、正态性、方差齐性则采用方差分析,否则采用秩和检验。以p<0.05为有统计学意义。绘制ROC曲线,寻找最佳临界点,进而确定灵敏度和特异度等衡量诊断准确性的指标。结果:（1）目的片段的分子克隆、重组质粒的构建。采用胍盐酸法提取了基因组DNA,并以此为模板成功克隆出了GSPT2-330基因。构建了pGEX-4t-1-GSPT2-330重组质粒,并将其转化入大肠杆菌DH.5α内。（2）融合蛋白的表达、纯化和酶切。含重组质粒的DH.5α经1.0mM IPTG诱导后在50KDa左右的位置出现一新蛋白条带,并且为可溶性蛋白,存在于裂解液上清中。对融合蛋白采用GST Sefinose^TM Resin亲和层析柱纯化,纯化后的蛋白在50KDa左右的位置,与蛋白表达出的位置一致。凝血酶酶切GST-eRF3b-110融合蛋白后,通过电泳发现,原来位于50KDa左右的GST-eRF3b-110融合蛋白被切成了24KDa左右的eRF3b-110蛋白和26KDa左右的GST蛋白。对电泳分离的eRF3b-110条带切胶回收进行质谱分析,结果显示目的条带与eRF3b-110蛋白的氨基酸序列匹配,证实了目的条带确实为eRF3b-110蛋白。（3）多克隆抗体的检测。对制备的多克隆抗体进行效价测定,结果显示兔多克隆抗体效价为1:384,000,大鼠多克隆抗体效价为1:51,200。对克隆的GST-eRF3b-110、eRF3b-110、GST蛋白进行Western blot鉴定,当兔多抗按1:5000稀释时,Odyssey红外荧光成像系统扫描硝酸纤维素膜（NC膜）的结果显示,在50KDa左右的位置可见GST-eRF3b-110融合蛋白的条带,在24KDa左右的位置可见eRF3b-110的条带,而GST条带在膜上未见;当大鼠多抗按1:500稀释时,扫膜的结果显示,在50KDa左右的位置可见GST-eRF3b-110融合蛋白的条带,在24KDa左右的位置可见eRF3b-110的条带,在26KDa左右的位置可见GST条带。对HepG2细胞中eRF3b蛋白进行Western blot鉴定,无论是兔多抗还是大鼠多抗,在NC膜上均可见eRF3b单一蛋白条带。（4）多克隆抗体纯化的结果。抗体经过protein A亲和层析柱纯化后,兔多抗效价为1:192,000,大鼠多抗效价为1:25,600。纯化后的抗体进行12%SDS-PAGE,结果可见在50KDa左右的位置有一条IgG重链条带,在25KDa左右的位置有一条IgG轻链条带。经BCA总蛋白定量试剂盒定量,纯化后的兔多抗浓度为1.2mg/ml,纯化后的大鼠多抗浓度为0.8mg/ml。（5）双抗体夹心ELISA法的建立及病人血清中eRF3b含量的检测。包被抗体为兔抗eRF3b多克隆抗体,最适包被浓度为4μg/ml;检测抗体为大鼠抗GST-eRF3b多克隆抗体,最适检测浓度为4μg/ml;酶标抗体为HRP标记的羊抗大鼠IgG,最适稀释比为1:2000。通过绘制蛋白标准曲线,判定检测最低阳性界值为3.9ng/ml。测定49例正常对照（control）、36例CHB患者、34例HBV-Cirr患者、30例HBV-HCC患者血清中eRF3b含量。结果显示,HBV-Cirr患者血清中eRF3b浓度的中位数为5.79ng/ml,显著高于control、CHB、HBV-HCC组（p值均小于0.007）,control组eRF3b浓度的中位数为1.50ng/ml,CHB组中位数为1.09ng/ml,HBV-HCC组中位数为2.10ng/ml,这三组之间血清中eRF3b浓度无显著性差异。基于ROC曲线分析,区分肝硬化和非肝硬化（包括正常对照、慢性乙肝、肝癌）的最适临界值为3.84ng/ml,在此浓度时,诊断试验的灵敏度、特异度和准确度分别为70.6%、73.9%和73.2%;区分肝硬化和其它乙肝相关性疾病（包括慢性乙肝、肝癌）的最适临界值为2.82ng/ml,在此浓度时,诊断试验的灵敏度、特异度和准确度分别为76.5%、68.2%和71.0%。结论:（1）克隆出GSPT2-330基因,并构建了pGEX-4t-1-GSPT2-330重组质粒。（2）表达、纯化出GST-eRF3b-110融合蛋白,凝血酶酶切获得eRF3b-110蛋白。（3）制备并纯化了兔抗人eRF3b多克隆抗体和大鼠抗人GST-eRF3b多克隆抗体。（4）建立了双抗体夹心ELISA检测血清中eRF3b含量的方法,并且测定了不同病情病人血清中eRF3b的浓度,对eRF3b在HBV感染肝硬化诊断试验中的准确性进行了评价。