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研究背景激素性股骨头坏死(Steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH)是骨科常见的难治性髋关节疾病,已逐渐占到非创伤性股骨头坏死的首位,但其确切的病因及发病机制尚不明确。激素及其代谢产物诱导骨微血管内皮细胞损伤导致的股骨头微循环障碍可能是股骨头坏死发生发展的重要原因,长期大剂量应用激素能够通过影响骨微血管内皮细胞相关功能蛋白和基因的表达,引起骨微血管内皮细胞凋亡、新生血管形成障碍,血管舒缩功能失调及凝血和纤溶功能异常等,进而引起股骨头内血液循环功能障碍,引起骨组织缺血坏死。既往研究提示淫羊藿苷具有促进血管新生、调节血管舒缩性和保护血管内皮细胞免受氧化应激损伤等药理作用,本实验室前期从细胞层面也研究证实,淫羊藿苷可以明显阻断激素诱导的骨微血管内皮细胞的损伤凋亡,但其具体分子作用机制还有待进一步研究。目的本课题研究主要包括两个部分主要内容,第一部分：通过体外建立激素诱导骨微血管内皮细胞损伤模型及淫羊藿苷预处理模型,探讨淫羊藿苷对激素诱导骨微血管内皮细胞损伤后细胞凋亡及细胞迁移能力的影响,寻找淫羊藿苷保护激素诱导损伤骨微血管内皮细胞可能作用的靶蛋白或相关蛋白。第二部分,通过体外建立激素诱导骨微血管内皮细胞损害模型及淫羊藿苷预处理模型,探讨淫羊藿苷对激素诱导损伤骨微血管内皮细胞mi-RNAs表达谱的差异,寻找淫羊藿苷可能作用的mi-RNAs分子靶点,并确定明显差异表达mi-RNAs的功能。方法第一部分：体外分离培养人股骨头骨微血管内皮细胞,建立激素诱导骨微血管内皮细胞损伤模型及淫羊藿苷预处理模型,采用TUNEL法检测骨微血管内皮细胞凋亡率,细胞划痕实验测定骨微血管内皮细胞体外迁移能力,通过蛋白芯片观察BMECs蛋白质表达谱变化。第二部分：体外分离培养人股骨头骨微血管内皮细胞,建立激素诱导骨微血管内皮细胞损伤模型及淫羊藿苷预处理模型,采用mi-RNAs基因芯片筛选明显表达差异mi-RNAs,并对明显表达差异mi-RNAs行RT-qPCR验证,同时探讨淫羊藿苷对明显表达差异ni-RNAs的影响,利用生物信息学软件预测它们可能作用的靶基因及信号通路。结果第一部分1、激素组骨微血管内皮细胞凋亡率(46.93+5.8%、78.03+8.5%)较正常对照组(4.8±1.3%)明显升高,淫羊藿苷+激素组细胞凋亡率(15.17±7.7%、44.57+5.3%)较激素组明显降低,各组间比较有显著性差异(均P<0.001)。2、激素组骨微血管内皮细胞划痕培养72h后迁移距离(13.244±0.32μm)与正常对照组(5.28±±0.31μm)相比具有明显统计学差异(P<0.05),淫羊藿苷+激素组骨微血管内皮细胞向损伤区的迁移距离(6.12±0.15μm)较激素组明显改善(P<0.05),而与正常对照组相比较无明显差异。3、蛋白质芯片筛选结果发现激素组的促血管生成因子G-CSF表达较正常对照组降低,同时炎性因子IL-4表达升高(P<0.05,Ratio>2)；淫羊藿苷+激素组的促血管生成因子G-CSF表达较激素组升高,同时炎性因子IL-4表达降低(P<0.05,Ratio>2),凋亡因子表达无明显变化。第二部分1、对骨微血管内皮细胞mi-RNAs基因芯片结果进行差异性分析,与正常组相比较,激素组中差异倍数>2,P<0.05的mi-RNAs共有5个,其中1个表达上调,4个表达下调,其中miR-339表达上调,miR-23b、miR-100、miR-222和miR-933表达下调,mi-RNAs表达上调、下调最为显著分别是miR-339和miR-23b；2、荧光实时定量PCR结果证实,与正常组相比,miR-23b表达显著减少,miR-339表达显著增加(P<0.05),结果与基因芯片结果一致；而与激素组相比,淫羊藿苷预处理可以显著提高miR-23b表达,纠正其表达偏差(P<0.01)3、通过miRanda、PicTar、miRDB、TargetScan数据库对miR-23b可能作用的靶基因进行生物学信息检测发现,共筛选出23个miR-23b可能作用的靶基因。通过靶基因通路分析和初步基因功能分类的方法发现,miR-23b作用的相关信号通路可能包括：JAK-Stat5通路、Notch通路、Wnt/JN K通路、RPTPβ通路、PPARγ通路、PI3K/Akt/mTOR通路、ERK1/2通路、RTK通路、MAPK通路,可能的基因功能包括：调控细胞增殖、分化、凋亡,促进血管形成,参与免疫调节,介导炎症反应等。结论1、淫羊藿苷可以显著抑制糖皮质激素诱导的骨微血管内皮细胞凋亡,保持体外迁移能力,并可提高促血管生成因子G-CSF的表达,抑制炎性因子IL-4表达,淫羊藿苷阻断激素诱导骨微血管内皮细胞损伤的作用机制趋向于通过上调促血管形成蛋白表达及下调炎性蛋白的表达来实现,可能对激素性股骨头坏死的防治具有正向作用。2、激素诱导骨微血管内皮细胞损伤后可导致mi-RNAs表达谱发生明显变化,淫羊藿苷可以有效预防激素诱导骨微血管内皮细胞损伤引起的miR-23b表达失衡,本实验结果提示淫羊藿苷可能通过介导骨微血管内皮细胞miR-23b的表达参与激素性股骨头坏死病理过程的调控。由此我们推测淫羊藿苷可能通过调节miR-23b的表达,调控凋亡或血管形成相关靶mRNA基因的表达,进而上调(或下调)凋亡或血管形成相关蛋白质的合成,最终影响细胞功能、干预激素性股骨头坏死的病理过程。miR-23b介导的治疗作用可能是淫羊藿苷防治激素性股骨头坏死的新机制,为研究激素性股骨头坏死的发病机制及早期防治提供了新的切入点,值得进一步深入研究。