论文部分内容阅读
目的:衰老是随着年龄增加,机体逐渐出现退行性变化。而非健康衰老会使老年人与增龄相关的神经退行性疾病的患病率升高,造成认知功能障碍。随着全球人口高龄化的加剧,高龄群体患老年疾病的风险也随之升高。基于此,研究有效的药物来改善衰老,预防衰老带来的老年化疾病,提高老年人生命质量,是当前研究衰老的主要工作。中医认为,肾精日渐亏虚是衰老发生的根本,补肾填精生髓是延缓衰老的重要手段。牛膝味甘性微温,入肝肾经,具有补肝肾,强筋骨的功效,其在古今抗衰老方药中应用较为广泛。所以本研究通过D-半乳糖建立小鼠和神经干细胞的体内外衰老模型,综合评价牛膝干预衰老的药效,运用UPLC-MS/MS对药效组分进行成分研究,探索其改善衰老的药效物质基础。方法:首先,连续10周大剂量注射D-半乳糖诱导小鼠衰老模型,造模的同时给予低、中、高剂量的牛膝提取物,观察实验期间各组小鼠日常状态、体重、脏器指数和行为学的变化,采用水迷宫实验评价各组小鼠的学习记忆能力,通过旷场实验对各组小鼠的自主活动和探究行为进行分析,接着用HE染色法对各组小鼠的海马神经元病理变化进行分析。其次,牛膝经醇提水沉、萃取、大孔树脂和凝胶柱的分离,以原代神经干细胞为载体,采用CCK-8检测手段进行促增殖活性追踪,将活性组分作用于衰老神经干细胞来进行药效评价。最后,通过UPLC-MS/MS对追踪到的活性组分进行成分分析,挖掘牛膝干预衰老可能的功效组分。结果:模型组小鼠出现体重增量减缓、精神萎靡嗜睡、行动迟钝、毛发黯淡和摄食量减少等现象,与模型组比较,阳性药和牛膝各剂量组的日常状态均有所改善。模型组小鼠大脑和肾脏的脏器指数减小(p<0.05),牛膝中剂量组能显著提高大脑和肾脏的脏器指数(p<0.05)。在旷场实验中,牛膝各剂量组能提高小鼠中心区域活动时间和后肢站立次数(p<0.05)。在水迷宫实验中,牛膝中、高剂量组能明显缩短小鼠定向航行实验的逃避潜伏期(p<0.05);牛膝各剂量组能提高小鼠空间搜索实验的原平台象限停留时间和穿越原平台次数(p<0.05);牛膝各剂量组小鼠在反向平台实验中,找到新平台的逃避潜伏期明显缩短(p<0.05)。小鼠海马组织病理学分析,模型组小鼠海马区域的神经元排列疏松,神经元密度和数量减少,细胞层数减少,间隙增大,胞浆颜色深,神经元核固缩,变性坏死;牛膝各剂量组的海马神经元有所改善,损伤减轻,神经元密度和数量增多,间隙减小,核固缩和神经元凋亡减少。实验成功原代培养出神经干细胞,通过D-半乳糖建立神经干细胞衰老模型。在活性追踪中,牛膝能促进神经干细胞增殖(p<0.05),且其正丁醇部位经Sephadex LH-20柱分离流分(nB-Fr.α.2)的促神经干细胞增殖效果较好(p<0.05)。nB-Fr.α.2能提高衰老神经干细胞的存活率(p<0.05)。nB-Fr.α.2经UPLC-MS/MS分析,其主要为三萜皂苷类成分。结论:实验首次运用“肾-脑理论”来研究牛膝抗衰老的药效。结果表明牛膝能提高衰老小鼠的学习记忆能力及自主活动、探究能力,减少大脑海马神经元凋亡,改善神经元损伤。且其对正常及衰老神经干细胞有促增殖作用。这与中医“补肾填精生脑髓”的抗衰老方药理论相呼应。首次为牛膝在“肾-脑理论”的抗衰老研究方面提供了实验依据,并且填补空白。同时,采用活性追踪方法,追踪到牛膝对神经干细胞发挥抗衰老和神经保护作用的活性组分。首次初步掌握了牛膝促衰老神经干细胞增殖的药效物质基础,为其指导临床精准用药提供一定的理论依据。