背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是严重威胁人类健康的常见疾病和多发病,例如脑血管、冠状动脉、外周动脉闭塞疾病等,本类疾病有极高的发病率、致残率和致死率,成为我国和大多数西方国家的主要疾病负担。动脉粥样硬化在早期的病理学中被描述为一种终末期退行性疾病,它会导致动脉管腔的广泛性狭窄,其发生过程及其复杂,是由多种因素参与的慢性炎症过程。其中内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞与动脉粥样硬化斑块的形成有着密切的联系。动脉粥样硬化所导致的动脉狭窄,目前治疗方式主要有球囊扩张、支架成形及搭桥手术。球囊扩张术及血管内支架成形术被认为是治疗外周动脉闭塞疾病安全有效的方法,近年来已被广泛应用。这项技术可以在短期内提高血管开放率,然而术后再狭窄率和再闭塞率严重影响了支架成形术的疗效,据报告股胭动脉植入裸支架一年后的通畅率仅为59%-81%,有5-10%的患者出现了急性支架内血栓性闭塞[2],居高不下的血管成形术后再狭窄(ISR)率成为限制本类疾病远期治疗疗效的“杀手锏”,已经成为血管外科急需解决的重要问题之一。血管再狭窄的本质是血管损伤后由多种细胞因子和生长因子介导的一种局部修复(wound healing)反应。研究普遍认为它是一种多因素、多种机制共同参与的过程,而其核心机制是血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecell, VSMC)的增殖、迁移。血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移在血管重建性疾病(vascular remodeling diseases,VRD)的病理过程中起重要作用,对VSMC增殖、迁移相关信号变化或细胞表型变化的研究能为阐明血管再狭窄的发生机制及治疗提供有益的思路[6]。我们的前期研究(Liu H, Dong W, Lin Z, Lu J, Wan H, Zhou Z, Liu Z. CCN4 regulates vascular smooth muscle cell migration and proliferation. Mol Cells.2013 Aug;36(2):112-8.)发现：CCN4处理能增强体外培养的VSMC细胞间的结合力,同时细胞的迁移和增殖能力也明显提升。另外,我们还发现WISP1处理VSMC后,细胞表型标志基因的表达发生变化,一些合成型标志基因(如elastin和osteopontin等)表达明显上升,而收缩型标志基因(如α-actin等)表达明显下降。但目前,基质细蛋白——CCN4促进VSMC表型转化、增殖和迁移的调控机制未见报道。WISP1在血管再狭窄等血管疾病间的关系还有待进一步的研究。近年来发现,P13K和其下游分子蛋白激酶B(PKB或Akt)所组成的信号通路与血管术后再狭窄的发生、发展密切相关。该通路调节血管平滑肌细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致VSMC的异常增殖、迁移,而且以及细胞外基质的降解等相关。PI3K-Akt通路的作用主要是通过激活Akt起作用,激活的Akt分子可激活下游众多靶分子。已见多个研究报道在血管受损伤刺激的模型中,活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋如GSK-3、 MMP9、cyclinDl等,进而调节血管平滑肌细胞的增殖、分化、以及迁移等,最终导致再狭窄的发生。本研究中的分子WISP1又名CCN4(下文中称WISP1),是一种可由成纤维细胞、平滑肌细胞等多种细胞合成分泌多功能的细胞外基质蛋白。WISP1是wnt通路下游的一个蛋白,在体内有行使调控迁移、增殖、免疫调节、肿瘤生成等作用。 可能是一系列疾病(如外伤、神经退化、骨骼肌疾病、心血管疾病、肺纤维化、肿瘤生长与远处转移等)的治疗新靶点。研究表明WISP1可激活Akt/PKB抗凋亡信号通路：在DNA损伤所致的P53激活以诱导凋亡中,线粒体释放细胞色素c,上调抗凋亡Bcl-XL,而WISP1可通过激活Akt分子抑制上述二者的活动以抑制细胞凋亡。在神经元缺糖缺氧模型中,WISP1通过激活Akt信号保护神经元。在促进关节滑膜纤维化过程中,WISP1也是通过激活Akt信号促使纤维细胞向纤维细胞的分化。目的我们由上述背景资料推测：WISP1可能通过与Akt信号通路调节VSMC的增殖和迁移,从而参与血管再狭窄的发生。本研究拟通过WISP1对于人胸主动脉血管平滑肌细胞(HAVSMC)增殖和迁移的作用及相关信号通路的研究,以试图进一步探寻WISP1对血管平滑肌细胞增殖和迁移的调控机制,为寻求新的血管再狭窄治疗药物提供科学依据和理论基础,并为药物球囊的设计提供新的药物靶点。简言之,本研究的目的为(1)检测血管平滑肌细胞增殖过程中WISP1的表达关系；(2)检测WISP1蛋白与血管平滑肌细胞增殖和迁移关系；(3)探索WISP1蛋白调控血管平滑肌细胞增殖和迁移信号通路。方法(1)观察在不同浓度血清引起HAVSMC增殖状态下细胞WISP1蛋白表达水平的影响：在细胞体外培养条件下,使用不同浓度血清(0%FBS、 2%FBS、10%FBS)培养胸主动脉血管平滑机细胞(HAVSMC)48小时后,使用EdU细胞增殖检测法检测组别间HAVSMC的增殖状态,同时利用Western blot技术检测WISP1的表达量,统计各组间差异。(2)构建WISP1在HAVSMC中的过表达及缺失模型并验证：使用腺病毒转染技术,分别转染含WISP1基因的腺病毒及空载体病毒(MOI=10),转染后24小时、48小时在荧光显微镜下拍照,48小时后利用Western blot技术检测转染病毒后两组细胞中WISP1蛋白的表达水平。(3)EdU细胞增殖检测方法检测过表达WISP1对细胞增殖变化影响：转染WISP1过表达腺病毒及空载体病毒后24小时,使用EdU细胞增殖检测方法检测转染病毒后两组细胞增殖水平,统计各组间EdU标记阳性细胞个数比值差异。(4)细胞划痕实验方法检测WISP1对细胞迁移的影响：转染WISP1过表达腺病毒及空载体病毒后24小时,选取5个不同时间点(0小时、6小时、12小时、24小时、48小时)在显微镜下观察并记录转染病毒后两组细胞迁移的情况,统计两组间细胞迁移速度差异。(5) Transwell细胞迁移实验方法检测WISP1对细胞迁移的影响：转染WISP1过表达腺病毒及空载体病毒后24h,收集细胞接种至Transwell小室上室(细胞数约为5×104个细胞),迁移24小时后固定、染色,显微镜下拍照,统计两组间迁移细胞个数差异。(6)观察WISP1诱导HAVSMC增殖及迁移的信号通路激活情况：转染WISP1过表达腺病毒及空载体病毒后24小时,利用Western blot技术检测Akt, p-Akt的表达量,统计分析p-Akt/Akt比值差异。(7)验证Akt信号在WISP1诱导HAVSMC增殖及迁移中的作用：转染WISP1过表达腺病毒及空载体病毒后24小时,使用或不使用Akt抑制剂AZD5363(浓度=5μM)处理转染后的细胞,分别使用上述检测增殖和迁移的方法,观察过表达WISP1后抑制剂对HAVSMC增殖及迁移作用的影响,并使用Western blot技术检测Akt下游分子p-GSK3/GSK3、MMP9、cyclinD1蛋白的表达情况。结果(1)转染后24小时、48小时在荧光显微镜下观察到转染病毒后两组细胞均表达绿色荧光,Western blot结果示,转染含WISP1腺病毒的细胞(过表达WISP1组)中WISP1蛋白的表达水平显著高于转染空载体病毒细胞组(空载体细胞组)(P<0.05)。(2)经体外贴壁培养细胞48小时后,血管平滑肌细胞的EdU标记阳性细胞个数比值与血清浓度呈剂量依赖方式增加,对比无血清培养的血管平滑肌细胞,EdU标记阳性细胞数比值分别增加2.5倍(2%FBS)和3.0倍(10%FBS) (P<0.05)。低血清组细胞和高血清组细胞的WISP1表达水平明显高于无血清培养细胞,WISP1蛋白表达量分别增加3.4倍(2%FBS)和4.1倍(10%FBS),差异有统计学意义(P<0.05)。(3)EdU细胞增殖检测结果显示：转染后24小时,与空载体组细胞相比,过表达WISP1组的血管平滑肌细胞EdU标记阳性细胞个数比值升高2.98倍,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)细胞划痕实验结果显示：转染后24小时,与空载体组细胞相比,过表达WISP1组的血管平滑肌细胞增殖细胞在6小时开始明显快于空载体组细胞(4.56±1.14% vs.11.23±2.25%,p<0.05),并在48小时两组间差异达到最大(25.25±5.51%vs.97.54±13.12%,p<0.01)；过表达组细胞在48小时细胞接近于融合。(5) Transwell细胞迁移实验结果显示：转染后24小时,与空载体组细胞相比,过表达WISP1组的血管平滑肌细胞的迁移数量显著多于空载体组细胞,上升2.25倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6) Western blot检测结果显示：转染后24小时,与空载体组细胞相比,过表达WISP1组的血管平滑肌细胞增殖细胞中,转染后的p-Akt表达量明显增加,而总的Akt表达量未明显变化,经统计p-Akt/Akt比值升高3.2倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)转染WISP1过表达腺病毒及空载体病毒后24小时,使用或不使用Akt抑制剂AZD5363(浓度=5μM)处理转染后的细胞(共4组细胞)。其中,与单纯过表达组细胞相比,过表达WISP1组的细胞经AZD5363处理后,EdU标记阳性细胞数比值下调(P<0.05)；划痕实验显示：细胞迁移速度在12小时至48小时明显减慢(P<0.05)；Transwell细胞迁移实验结果显示：迁移24小时细胞数明显减少(P<0.05)。Western blot检测结果显示Akt下游分子：GSK3、MMP9、cyclinD1的蛋白表达也受到抑制,与单纯过表达组细胞相比,过表达WISP1组的血管平滑肌细胞中检测到p-GSK3/GSK3、MMP9、 cyclinD1蛋白的表达量都呈下降趋势(P<0.05)。结论(1)在不同浓度血清(0%FBS、2%FBS、10%FBS)刺激下的血管平滑肌细胞(HAVSMC)增殖水平呈增高趋势,促进增殖的过程中内源性WISP1表达与细胞增殖水平存在正相关关系。(2)过表达WISP1能够促进血管平滑肌的增殖及迁移。(3)WISP1促进血管平滑肌的增殖及迁移过程中伴随Akt信号通路激活。(4)阻断Akt信号可抑制WISP1调控血管平滑肌的增殖、迁移,同时下调Akt下游分子P-GSK3/GSK3、MMP9、cyclinD 1的表达水平。总之,WISP1促进血管平滑肌的增殖及迁移与Akt信号通路有关,这有可能是血管术后再狭窄的一个新的治疗靶点。