研究背景抑郁症是一种以连续且长期的心情低落为主要临床特征的心理疾病,具有高患病率、低治愈率的特点,已成为不容忽视的全球性健康危机。迄今为止,抑郁症的病因和发病机制尚不明确,诸多因素可能参与了抑郁症的发生发展。近年来,炎症尤其是神经炎症对抑郁症的影响受到广泛关注。神经炎症是中枢神经系统内的特异性炎症,能够通过炎症因子的神经毒性作用影响胶质细胞的神经元保护功能和神经发生,进而导致抑郁症。神经炎症反应中小胶质细胞起着至关重要的作用,小胶质细胞是神经炎症因子的主要来源细胞,小胶质细胞通过其两种极化表型M1型和M2型发挥调节神经炎症的功能。研究显示,M1型小胶质细胞分泌促炎因子损伤神经元,导致神经退变,M2型小胶质细胞分泌抗炎因子保护神经元,促进神经组织修复。因此认为小胶质细胞在神经炎症调节中具有双重作用。锌是人体内含量第二丰富的微量元素,具有结构、催化、调节功能。研究发现锌的摄入量与抑郁症发病风险呈明显负相关,且发现抑郁症患者中血清锌的含量普遍降低,而通过抗抑郁治疗后血清锌含量显著升高,同时研究发现补锌能够明显改善患者抑郁症症状。因此提示微量元素锌在抑郁症的发生发展中具有重要作用。课题组前期研究发现通过锌补充可以有效抑制小鼠小胶质细胞（BV-2）M1型极化,从而减少促炎因子的分泌,发挥保护神经元作用。综上所述,神经炎症和低锌是抑郁症的重要特征,小胶质细胞极化表型的可塑性调节是改善神经炎症的重要手段。本研究拟探索锌调节小胶质细胞极化的作用及其可能机制,为阐明锌调控神经炎症,进而改善抑郁症提供实验依据。研究目的1.阐明锌对神经炎症及炎症致抑郁样行为的作用。2.探索锌调节小胶质细胞极化及其在改善炎症致抑郁中的分子机制。研究方法一、动物分组及干预采用32只雄性6周龄SPF级C57BL/6小鼠为实验对象,适应环境5天后,随机分为4组,每组8只,分别为对照组（Control组）、炎症致抑郁模型组（LPS组）、低锌剂量组（Zn2.0组）、高锌剂量组（Zn4.0组）,其中对照组不进行干预。低锌剂量组和高锌剂量组从第1天至第28天起每日清晨进行氯化锌（Zn Cl2）灌胃,剂量分别为2.0 mg/kg/d和4.0 mg/kg/d。除对照组外,其余各组从第2周至第4周每周一、三、五进行腹腔注射250μg/kg脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）。二、行为学实验第24天至第28天进行糖水偏好实验,第29天进行旷场实验和悬尾实验。糖水偏好实验（surcose preference test,SPT）:将小鼠单笼饲养1天,蔗糖饮水适应性训练48 h,禁食禁水12 h,自由饮用1瓶2%蔗糖水和1瓶普通水,测定12 h内小鼠的糖水和普通水饮用量。糖水偏好指数（%）=蔗糖水饮用量/（蔗糖水饮用量+普通水饮用量）×100%。旷场实验（open field test,OPT）:将小鼠放入Open Field实验方箱底面,同时进行摄像,观察时间设定为6 min,记录并分析小鼠后5 min的自主运动总距离。悬尾实验（tail suspension test,TST）:将小鼠尾部用胶带固定于支架上,悬挂完成后开始摄像观察,观察时间设定为6 min,记录并分析小鼠后5 min的不动时间。三、锌含量测定生化法:采用单试剂法,将锌测定试剂盒中R1（Tris缓冲液）和R2（锌汞试剂）按说明书比例混匀配制标准工作液。在全自动生化仪上设置好相应参数。将小鼠血清样本上机后,进行全自动生化仪自动测定。原子吸收法:开机检测仪器,设置基本参数,先将标准溶液上机,检测标准品吸光度,并绘制标准曲线。再将小鼠前额叶皮质（prefrontal cortex,PFC）和海马（hippocampus,HIP）组织进行称重,用1 ml消化液消化后,上机检测样品吸光度,根据标准曲线计算出相应的浓度。四、炎症水平检测向待测小鼠海马和皮质中加入1 ml PBS进行匀浆,1000 g离心5 min,取上清液测定蛋白浓度后备用。取待测小鼠血清,1000 g离心5 min,取上清液备用。将待测上清液按照ELISA试剂盒说明书依次进行加样、加酶标抗体、加底物液显色、终止反应液、酶标仪检测450 nm处OD值。计算待检测样品中的肿瘤坏死因子-α（tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）和白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）的含量。五、细胞培养和干预BV-2小胶质细胞系,在6孔板中使用含有10%FBS+1%双抗的高糖DMEM,在37℃、5%CO2的培养箱中培养。培养至融合度50%后,进行分组干预。细胞实验分组为5组,分别为Control组、LPS组、Zn10组、Zn30组和Zn50组。Zn10组、Zn30组和Zn50组分别给予10μM、30μM和50μM Zn Cl2预处理2 h。而后除Control组外,每组给予1000 ng/ml LPS干预22 h,干预结束后进行下一步实验。六、小胶质细胞极化的标志性关键酶检测检测M1型极化标志酶诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）和M2型极化标志酶精氨酸酶-1（arginase-1,Arg-1）的m RNA及蛋白的表达。Western Blot:提取小鼠海马、皮质组织和BV-2细胞总蛋白,加蛋白上样缓冲液、100℃加热5 min、配制电泳用凝胶,加样,电泳,转膜,封闭,一抗孵育,荧光二抗孵育,Odyssey近红外成像仪扫描,获取图像,Image J软件进行数据分析。QPCR:Trizol法提取小鼠海马、皮质组织和BV-2细胞总RNA,反转录得到待测c DNA样品。按照QPCR试剂盒说明书配制c DNA、无酶水、目的基因引物、ROX Reference Dye、SYBR Green Mix混合的QPCR反应体系,使用PCR扩增仪进行扩增,检测Ct值,采用2-ΔΔCT法进行相对定量计算。七、小胶质细胞极化的标志性活性产物检测按NO和ROS检测试剂盒说明书检测BV-2细胞M1型极化标志活性产物一氧化氮（nitric oxide,NO）和活性氧（reactive oxygen,ROS）水平。采用鸟氨酸试剂盒检测BV-2细胞M2型极化标志活性产物鸟氨酸（ornithine）水平。八、小胶质细胞极化的标志性细胞膜蛋白检测检测M1型极化标志细胞膜蛋白CD86和M2型极化标志细胞膜蛋白CD206。组织免疫荧光:小鼠脑组织依次经液氮急速冷冻、OTC包埋剂包埋、冰冻切片、固定、抗原修复、封闭、一抗孵育、荧光二抗孵育、DAPI复染、封片剂封片后,荧光显微镜下观察,采集图像。细胞免疫荧光:BV-2细胞依次经爬片、干预、固定、抗原修复、封闭、一抗孵育、荧光二抗孵育,封片剂封片后,荧光显微镜下观察,采集图像。九、差异基因筛选及验证取小鼠的海马作为待检测对象,首先进行海马组织的RNA抽提,鉴定RNA纯度、含量和完整性后,构建转录文库。而后采用有参转录测序分析方法进行差异基因分析。利用QPCR和Western Blot的方法对对筛选出的差异基因和其表达蛋白进行验证。十、统计方法使用Excel 2016和Graph Pad Prism 8.0软件进行数据处理和图表绘制。所有数据进行正态性和方差齐性检验。数据采用单因素方差分析（One-way ANVOA）进行检验,组间比较采用Dunnett’s或LSD方法。P＜0.05认为差异有统计学意义。实验结果一、锌对LPS诱导的小鼠抑郁样行为及炎症水平、锌含量的作用（一）锌补充改善LPS诱导的小鼠抑郁样行为行为学实验结果显示:与Control组相比,LPS组小鼠糖水偏好指数下降（P＜0.05）、自主活动总距离下降（P＜0.05）、悬尾不动时间上升（P＜0.05）;与LPS组相比,Zn2.0和Zn4.0组小鼠糖水偏好指数上升（P＜0.05）、自主活动总距离上升（P＜0.05）、悬尾不动时间下降（P＜0.05）。（二）锌补充改善LPS诱导的小鼠炎症水平ELISA结果显示:与Control组相比,LPS组小鼠血清、海马及皮质中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均上升（P＜0.05）;与LPS组相比,Zn2.0和Zn4.0组小鼠的血清、海马及皮质中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均下降（P＜0.05）。（三）锌补充提高LPS诱导的小鼠体内锌含量血生化法和原子吸收法检测锌含量结果显示:与Control组相比,LPS组小鼠血清、海马及皮质中锌含量均下降（P＜0.05）;与LPS组相比,Zn2.0和Zn4.0组小鼠的血清、海马及皮质中锌含量均上升（P＜0.05）。二、锌对LPS诱导的小胶质细胞极化的作用（一）锌补充促进LPS诱导的抑郁小鼠脑内小胶质细胞向M2型极化1、Western Blot及QPCR结果显示:与Control组相比,LPS组小鼠海马及皮质中M1型的标志酶i NOS的m RNA及蛋白表达水平显著增高（P＜0.05）、M2型的标志酶Arg-1的m RNA及蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）;与LPS组相比,Zn2.0和Zn4.0组小鼠皮质及海马Arg-1的m RNA及蛋白表达水平明显增高（P＜0.05）而i NOS的表达水平显著下降（P＜0.05）。2、组织免疫荧光结果显示:与Control组相比,LPS组小鼠海马组织中M1型极化标志膜蛋白CD86荧光亮度显著增强,而M2型极化标志膜蛋白CD206荧光亮度明显减弱;与LPS组相比,Zn2.0组和Zn4.0组小鼠海马组织CD86荧光亮度显著减弱,CD206荧光亮度显著增强。（二）锌补充促进LPS激活的BV-2细胞向M2型极化1、Western Blot及QPCR结果显示:与Control组相比,LPS组BV-2细胞中M1型标志酶i NOS的m RNA及蛋白表达显著上升（P＜0.05）,而M2型标志酶Arg-1的m RNA及蛋白表达显著下降（P＜0.05）;与LPS组相比,Zn30组和Zn50组BV-2细胞中i NOS的m RNA及蛋白表达显著下降（P＜0.05）、Arg-1的m RNA及蛋白表达显著上升（P＜0.05）。2、NO、ROS和鸟氨酸检测结果显示:与Control组相比,LPS组BV-2细胞中M1型极化标志产物ROS和NO水平显著上升（P＜0.05）;M2型极化标志产物鸟氨酸的含量显著下降（P＜0.05）。与LPS组相比,Zn30组和Zn50组BV-2细胞中ROS和NO水平显著下降（P＜0.05）、鸟氨酸含量显著上升（P＜0.05）。3、细胞免疫荧光检测结果显示:与Control组相比,LPS组BV-2细胞中M2型标志性细胞膜蛋白CD206与M1型标志性细胞膜蛋白CD86含量的比值（CD206/CD86）显著下降（P＜0.05）;与LPS组相比,Zn30组和Zn50组BV-2细胞CD206/CD86的显著上升（P＜0.05）。三、锌改善LPS诱导的小胶质细胞极化的机制（一）转录组学筛选差异表达基因转录组测序结果显示:GO富集分析气泡图中主要的差异基因种类中有炎症应答（inflammatory response）和细胞因子活性（cytokine activity）;差异基因分组聚类图显示主要差异基因有P2X7、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β等。（二）锌补充对NLRP3炎症小体信号通路及P2X7蛋白的作用1、锌补充对LPS诱导的NLRP3炎症小体信号通路的作用动物实验:与Control组相比,LPS组小鼠海马中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的m RNA及蛋白表达显著上升（P＜0.05）;与LPS组相比,Zn4.0组的NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的m RNA及蛋白表达显著下降（P＜0.05）。细胞实验:与Control组相比,LPS组BV-2细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的m RNA及蛋白表达显著上升（P＜0.05）;与LPS组相比,Zn30组和Zn50组BV-2细胞中的NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的m RNA及蛋白表达显著下降（P＜0.05）。2、锌补充对LPS诱导的P2X7表达的影响动物实验:与Control组相比,LPS组小鼠海马中P2X7的m RNA及蛋白表达显著上升（P＜0.05）;与LPS组相比,Zn2.0和Zn4.0组的P2X7的m RNA及蛋白表达显著下降（P＜0.05）。细胞实验:与Control组相比,LPS组BV-2细胞中P2X7的m RNA及蛋白表达显著上升（P＜0.05）;与LPS组相比,Zn50组的P2X7的m RNA及蛋白表达显著下降（P＜0.05）。结论本研究通过建立LPS诱导的小鼠抑郁模型和LPS激活的BV-2细胞,首先观察锌补充对小鼠抑郁样行为及其小鼠体内锌含量和炎症水平的影响,进一步研究锌补充对LPS诱导的小鼠脑内小胶质细胞及BV-2细胞激活后极化的影响,最后探讨NLRP3炎症小体通路在锌改善LPS诱导的小胶质细胞极化中的作用。主要结果如下:1、锌补充能够改善炎症致抑郁小鼠的抑郁样行为,同时能够纠正LPS诱导的小鼠血清和脑锌含量下降以及血清及脑促炎因子水平升高。2、锌补充能够促进炎症致抑郁小鼠脑内小胶质细胞和LPS激活的BV-2细胞向M2型极化转变,抑制其向M1型极化转变。3、锌补充可通过抑制LPS诱导的P2X7表达进而抑制NLRP3炎症小体通路的激活,调节小胶质细胞极化综上,锌补充可通过抑制P2X7表达进而抑制NLRP3炎症小体通路的激活,这可能是锌抑制小胶质细胞M1型极化,促进M2型极化转变,进而改善神经炎症,发挥抗抑郁作用的重要途经。