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缺乏肿瘤特异性是现今许多肿瘤治疗方案所共同面临的一个主要问题,因此研发出新的肿瘤靶向机制的治疗方法显得非常必要。肿瘤细胞特异性增殖病毒,又称溶瘤病毒,在肿瘤治疗中极具前景,它具有选择性地在肿瘤细胞中增殖、在肿瘤间自行扩散的优点,且同现有的治疗手段无交叉耐药作用。到目前为止,已有十余种不同类型的选择性增殖型病毒进入到临床试验中,其中包括选择性增殖型腺病毒(CRAD)、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒、呼吸道肠道过滤性病毒及新城疫病毒。为达到选择性增殖的目的,对选择性增殖性腺病毒最常采用如下两种分子改造策略:其一选择性缺失病毒在正常细胞复制必需而在肿瘤细胞中非必需的基因,这些基因包括腺病毒的E1A基因及E1B基因,它们可以灭活在肿瘤细胞内常突变的抑癌基因Rb或p53。这种改造后的增殖病毒在动物实验中疗效显著,并已进入临床试验,经典的如美国ONYX药物公司研制的E1B-55KD缺失的ONYX-015,其联合常规化疗(5-Fu、顺铂)治疗30例复发的头颈部肿瘤患者,临床有效率可达63%,但作为单剂治疗疗效仅在20%左右,可能同E1B基因同时也参与晚期mRNA转运出核的过程这一特性有关。另一改造策略是利用组织或肿瘤特异性启动子,如AFP、MUC1,PSA及pS2等,来调控腺病毒增殖的必需基因,这种改造后的病毒在动物实验中非常成功,前列腺肿瘤特异性增殖型腺病毒CN-706及CV-787已进入临床试验,然而经此途径改造的病毒其增殖被局限于仅能表达相应肿瘤特异性抗原的肿瘤类型。 肿瘤细胞的无限增殖和瘤内缺氧微环境的存在是恶性实体瘤的主要特性。肿瘤的无限增殖能力主要靠端粒酶的激活来不断地维持端粒的长度而达到的。端粒酶在大多恶性肿瘤细胞中处于激活状态而在正常细胞中却没有活性或者活性很低,是目前所报道最为广谱的肿瘤生物分子标记。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是维持端粒酶活性所必需的催化亚单位,它的表达调控在转录水平上。利用端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)来调控病毒复制增殖所必需的基因,理论上可使病毒选择性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中增殖。同时在肿瘤细胞的恶性增殖过程中,不断增多的肿瘤细胞导致细胞耗氧量的剧增,容易造成肿瘤内缺氧微环境的形成,这在人实体瘤显得尤为明显。缺氧进而可诱导缺氧诱导因子-1(HIF-1)的形成,<WP=6>HIF-1在多种肿瘤中广泛存在,它与一系列缺氧反应靶基因上的特定结合位点缺氧反应元件(HRE)结合,从而启动靶基因的转录表达,靶向HIF-1是肿瘤靶向治疗的又一热点。基于此,我们以恶性肿瘤无限增殖和肿瘤内缺氧这两大特性为靶点,用人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子及缺氧反应(HRE)启动子来分别调控腺病毒的E1A及E1B基因,从而使病毒的复制局限在端粒酶阳性的肿瘤。本文构建出人端粒酶逆转录酶启动子和缺氧反应启动子双调控的可携带抗癌基因减毒增殖型腺病毒CNHK500,通过体外实验对CNHK500的选择性杀伤肿瘤细胞的能力进行评估,并进一步观察不同给药途径CNHK500对裸鼠移植瘤的治疗效果,对其抗肿瘤机制进行初步探讨。方法和结果:1、人端粒酶逆转录酶启动子和缺氧反应启动子双调控减毒增殖型腺病毒CNHK500的构建和制备先后经两次定点突变重叠PCR技术,分别使腺病毒内源性的E1A启动子缺失,并在pXC1载体464bp处引入7个新的、单一的酶切位点,为Age I-Bst BI-Not I-SpeI-Sal I-Xho I-Swa I,使腺病毒E1B启动子缺失并引入SpeI酶切位点,并将全长基因合成的人端粒酶逆转录酶启动子和缺氧反应启动子分别插入腺病毒E1A及E1B基因的上游,得到由hTERT启动子调控E1A基因及缺氧反应启动子调控E1B基因的减毒增殖型腺病毒载体质粒pSG500。将pSG500与含有5型腺病毒载体右臂的质粒pBHGE3共转染293细胞,9-14天后出现病毒空斑,经过三次病毒空斑纯化,提取病毒DNA行PCR鉴定,正确重组病毒命名为CNHK500。将病毒CNHK500在293细胞中反复扩增,通过氯化铯梯度离心法纯化病毒,用TCID50方法测得重组腺病毒滴度达到1.9×1010pfu/ml。2、双调控增殖腺病毒CNHK500体外抗肿瘤疗效观察CNHK500的E1A、E1B蛋白表达检测:通过Western blot检测CNHK500的E1A、E1B蛋白的表达,发现重组病毒CNHK500的E1A蛋白表达存在细胞差异性,在肿瘤细胞(HT29、PANC-1、HepGII、Hep3B)中可检测到腺病毒早期蛋白E1A的表达,而在正常细胞中(MRC-5、IMR-90、BJ)中则难以检测到E1A的表达,说明人端粒酶逆转录启动子可以有效调控E1A基因的表达。重组病毒CNHK500的E1B蛋白表达受到氧浓度条件的限制,当肝癌细胞株Hep3B、HepGII在MOI=1时感染CNHK500,<WP=7>在常氧状态下(21% O2)难以检测到E1B的表达,而在相同MOI值,对感染CNHK500的细胞进行缺氧(<1% O2)处理,可明显检测到E1B蛋白的表达,而感染CNHK500的正常细胞无论常氧还是缺氧状态都难以检测到E1B蛋白的表达,说明用缺氧反应启动子来调控腺病毒的E1B基因能成功调控E1B蛋白的选择性表达。病毒增殖实验:分别用重组腺病毒CNHK500感染不同来源的肿瘤细胞株,观察不同时相(0h、12h、24h、48h、96h)的病毒增殖情况,发现CNHK500在肿瘤细胞中能随时间而大量复制增殖。用不同腺病毒WtAd5、ONYX-015、CNHK500、CNHK300分别感染不同来源的肿瘤细胞和正常细胞,观察它们在不同细胞间的增殖差异。实验结?