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冠状动脉微栓塞（Coronary Microembolizaiton,CME）是急性冠脉综合征患者冠状动脉发生粥样硬化后易损斑块破裂,或者经皮冠状动脉介入治疗时微血栓栓子或动脉粥样硬化斑块碎屑进入冠状动脉微循环所导致的微循环血管堵塞。CME引起的无复流是冠脉介入治疗过程中的常见并发症,而无复流是影响患者远期预后的主要因素。多个研究也表明CME与心脏不良事件的发生相关,包括左室重构及死亡率增加。尽管对CME的研究已经取得了一定的进展,但目前仍缺乏有效治疗CME的办法,对CME的防治是临床亟待解决的棘手难题。研究表明,CME主要的病理生理基础之一是心肌细胞持续性的缺血缺氧（IH）,因此在细胞基础上建立心肌细胞的缺血与缺氧模型对研究CME的具体分子机制十分必要。自噬是一种对心肌细胞十分重要的生理过程。正常自噬可为心肌细胞提供能量及细胞内的自我更新,对在缺氧、能量缺乏等环境维持细胞的正常生理功能并降低心肌细胞损伤具有必不可少的作用。自噬不足或者自噬过度均可引起各种心血管疾病的发生。但自噬在持续IH环境的活化水平及其作用机制,目前相关研究仍有限。Micro RNAs（mi RNAs）是一类小分子非编码RNA,可通过对m RNA进行转录后调节,广泛参与各种心血管疾病的病理生理过程。但mi RNAs能否通过对自噬的调节,参与到IH环境对心肌细胞的损伤,目前相关研究仍较少。本课题组前期建立在大鼠冠状动脉微血管栓塞模型的研究得出,mi R-30e-3p表达显著降低。Mi R-30e-3p是mi R-30家族成员之一。mi R-30家族已经被证实在预防心肌肥厚或者心肌缺血再灌注损伤发挥着重要作用。但在持续IH环境中,mi R-30e-3p能否通过调控自噬从而减少心肌细胞损伤,目前仍不明确。本研究通过构建新生Sprague Dawley（SD）大鼠心肌细胞IH模型,在体外观察IH环境引起心肌细胞自噬水平的变化及其特点,对IH环境下mi R-30e-3p在心肌细胞表达变化及其作用进行探讨,从细胞水平对mi R-30e-3p调控自噬的变化在IH致心肌细胞损伤的作用进行研究。第一部分Mi R-30e-3p与心肌细胞自噬在缺血缺氧环境表达水平变化目的:建立大鼠原代心肌细胞IH模型,观察心肌细胞mi R-30e-3p表达与自噬水平的变化。方法:体外培养新生SD大鼠心肌细胞,根据IH时间点分5组,即0 h、3 h、6 h、9 h、12 h组,每组10只新生SD大鼠备取心肌细胞。以无血清低糖培养基模拟缺血环境,以缺氧培养罐模拟缺氧环境。MTS法检测各组心肌细胞活性;乳酸脱氢酶（LDH）检测心肌细胞损伤程度;RT-q PCR检测mi R-30e-3p表达水平;Western blot检测LC3、p62及cleaved caspase 3蛋白表达;透射电镜观察心肌细胞超微结构、自噬体及自噬溶酶体;m RFP-GFP-LC3腺病毒转染心肌细胞后以激光共聚焦显微镜检测自噬流变化;流式细胞仪检测Annexin V-FITC/PI双染的心肌细胞凋亡。结果:1.原代心肌细胞在IH环境,与0 h组相比,IH 6 h、9 h及12 h组的心肌细胞活性明显下降。与0 h组相比,LDH值在IH 3 h、6 h、9 h及12 h组显著升高,心肌细胞损伤随IH时间增加而逐渐增多。2.与0 h组相比,RT-q PCR检测心肌细胞mi R-30e-3p表达水平在IH 6h、9 h及12 h组表达明显降低。3.Western blot检测自噬关键蛋白表达变化,与0 h组相比,IH 3 h及6 h组LC3II蛋白表达明显增加,p62蛋白表达减少;IH 9 h及12 h组LC3II蛋白表达明显减少,p62蛋白表达显著增加。4.透射电镜观察0 h组心肌细胞,线粒体形态正常,无水肿或空泡;IH后可见心肌细胞自噬体及自噬溶酶体增加,线粒体出现水肿或者空泡化。但在IH 9 h及12 h组心肌细胞自噬体及自噬溶酶体减少。5.激光共聚焦检显微镜测心肌细胞自噬流,与0 h组相比,IH 3 h及6h组自噬流明显增强,IH 9 h及12 h组自噬流减弱。6.Western blot检测凋亡关键蛋白cleaved caspase 3变化,cleaved caspase 3蛋白表达于IH 3 h、6 h、9 h及12 h组明显增加;流式细胞仪检测心肌细胞凋亡显示,IH 3 h、6 h、9 h及12 h组细胞凋亡率逐渐增高。结论:IH造成心肌细胞mi R-30e-3p表达水平下降,心肌细胞自噬减少,心肌细胞损伤及凋亡增多。第二部分mi R-30e-3p通过Egr-1调控自噬对缺血缺氧致心肌细胞损伤的保护作用的研究目的:研究IH环境下心肌细胞mi R-30e-3p表达与自噬水平变化的关系,以及mi R-30e-3p是否通过Egr-1调控自噬介导IH致心肌细胞损伤。方法:体外培养新生SD大鼠心肌细胞,取9 h IH时间为干预时间点。分别以包含上调mi R-30e-3p、抑制mi R-30e-3p及mi R-30e-3p空载对照的慢病毒进行转染,以3-MA抑制自噬,分为对照组（Con）、缺血缺氧组（IH）、缺血缺氧+mi R-30e-3p病毒空载对照组（IH+NC）、缺血缺氧+mi R-30e-3p组（IH+MIR）、缺血缺氧+mi R-30e-3p拮抗剂组（IH+MIR Antagonist）及缺血缺氧+mi R-30e-3p+自噬抑制剂组（IH+MIR+3-MA）。将慢病毒直接加入细胞培养基中,感染复数（MOI）为50。病毒转染48 h后进行后续实验。3-MA在慢病毒转染前2 h加入细胞培养基中干预自噬。以无血清低糖培养基模拟缺血环境,以缺氧培养罐模拟缺氧环境。LDH检测心肌细胞损伤程度;RT-q PCR检测mi R-30e-3p及Egr-1 m RNA表达水平;Western blot检测LC3、p62、Egr-1及cleaved caspase 3蛋白表达水平;透射电镜观察各组心肌细胞超微结构变化、自噬体及自噬溶酶体;m RFP-GFP-LC3腺病毒转染心肌细胞后以激光共聚焦显微镜检测自噬流变化;流式细胞仪检测Annexin V-FITC/PI双染的心肌细胞凋亡。结果:1.原代心肌细胞在IH环境中,与Con组相比,LDH值在IH组、IH+NC组、IH+MIR组、IH+MIR Antagonist组及IH+MIR+3-MA组明显升高;与IH组相比,LDH值在IH+MIR组明显降低,在IH+MIR Antagonist组明显升高;与IH+MIR组相比,LDH值在IH+MIR Antagonist组显著升高。过表达mi R-30e-3p明显减少IH引起的心肌细胞损伤。2.RT-q PCR检测mi R-30e-3p与Egr-1 m RNA表达。与Con组相比,mi R-30e-3p表达在IH组、IH+NC组及IH+MIR Antagonist组明显降低,在IH+MIR组及IH+MIR+3-MA组明显升高,同时Egr-1 m RNA表达在各组IH环境中均升高;与IH组相比,mi R-30e-3p表达在IH+MIR组及IH+MIR+3-MA组明显升高,在IH+MIR Antagonist组明显降低,Egr-1m RNA表达在IH+MIR Antagonist组明显增加,在IH+MIR组明显减少;与IH+MIR组相比,mi R-30e-3p表达在IH+MIR Antagonist组明显降低,Egr-1 m RNA表达在IH+MIR Antagonist组明显增加。3.Western blot检测自噬关键蛋白表达变化,与Con组相比,在IH组、IH+NC组及IH+MIR Antagonist组,LC3II蛋白表达明显减少,p62及Egr-1蛋白表达增多;在IH+MIR组,LC3II蛋白表达明显增多,Egr-1蛋白表达明显减少;与IH组相比,LC3II蛋白表达在IH+MIR组明显增加,p62及Egr-1蛋白表达减少;与IH+MIR组相比,LC3II蛋白表达在IH+MIR Antagonist组明显降低,p62及Egr-1蛋白表达明显增加。4.透射电镜观察Con组心肌细胞,线粒体形态正常,无水肿或空泡;IH组、IH+NC组及IH+MIR Antagonist组线粒体出现水肿或者空泡化,自噬体及自噬溶酶体减少;IH+MIR组过表达mi R-30e-3p则增加心肌细胞自噬体及自噬溶酶体,同时线粒体水肿减轻。5.激光共聚焦显微镜检测心肌细胞自噬流,与Con组相比,IH+MIR组自噬流明显增强;与IH组相比,IH+MIR组自噬流明显增强;与IH+MIR组相比,IH+NC组、IH+MIR Antagonist组及IH+MIR+3-MA组自噬流显著减少。6.心肌细胞凋亡检测,与Con组相比,cleaved caspase 3蛋白表达及流式细胞仪检测心肌细胞凋亡显示,在IH组、IH+NC组、IH+MIR Antagonist组及IH+MIR+3-MA组凋亡明显增加;与IH组相比,IH+MIR组凋亡显著减少,IH+MIR Antagonist组凋亡明显增加;与IH+MIR组相比,IH+NC组、IH+MIR Antagonist组及IH+MIR+3-MA组凋亡明显增加。结论:1.IH引起的心肌细胞自噬程度与mi R-30e-3p水平密切相关;2.mi R-30e-3p通过Egr-1调控自噬介导IH致心肌细胞损伤。第三部分Egr-1/Bim/Beclin-1信号通路在缺血缺氧致心肌细胞损伤的作用机制研究目的:研究Egr-1/Bim/Beclin-1信号通路于IH环境激活的情况及其对心肌细胞自噬及损伤的作用机制。方法:体外培养新生SD大鼠心肌细胞,取9 h IH时间为干预时间点。分别以包含上调Egr-1、Egr-1 sh RNA及Egr-1空载对照的慢病毒进行转染,以3-MA抑制自噬,分为对照组（Con）、缺血缺氧组（IH）、缺血缺氧+Egr-1空载对照组（IH+NC）、缺血缺氧+Egr-1组（IH+Egr-1）、缺血缺氧+Egr-1 sh RNA组（IH+sh RNA）及缺血缺氧+Egr-1 sh RNA+自噬抑制剂组（IH+sh RNA+3-MA）。将慢病毒直接加入细胞培养基,MOI为50。转染48 h后进行后续实验。3-MA在慢病毒转染前2 h加入细胞培养基抑制自噬。以无血清低糖培养基模拟缺血环境,以缺氧培养罐模拟缺氧环境。LDH检测心肌细胞损伤程度;RT-q PCR检测Egr-1、Bim及Beclin-1 m RNA表达水平;Western blot检测Egr-1、Bim、Beclin-1、LC3、p62及cleaved caspase3蛋白表达水平;透射电镜观察各组心肌细胞超微结构变化、自噬体及自噬溶酶体;m RFP-GFP-LC3腺病毒转染心肌细胞后以激光共聚焦显微镜检测自噬流变化;流式细胞仪检测Annexin V-FITC/PI双染的心肌细胞凋亡。结果:1.原代心肌细胞在IH环境中,与Con组相比,LDH值在IH组、IH+NC组、IH+Egr-1组、IH+sh RNA组及IH+sh RNA+3-MA组明显升高;与IH组相比,LDH值在IH+sh RNA组明显降低,在IH+Egr-1组明显升高;与IH+sh RNA组相比,LDH值在IH+Egr-1组显著升高。心肌细胞损伤在抑制Egr-1蛋白表达后明显减轻。2.RT-qPCR检测Egr-1、Bim与Beclin-1 m RNA表达。与Con组相比,在IH组、IH+NC组及IH+Egr-1组,Egr-1 m RNA及Bim m RNA表达升高,Beclin-1 m RNA表达降低;与IH组相比,在IH+Egr-1组,Egr-1 m RNA及Bim m RNA表达升高,Beclin-1 m RNA表达降低,在IH+sh RNA组及IH+sh RNA+3-MA组,Egr-1 m RNA及Bim m RNA表达降低,Beclin-1 m RNA表达明显升高;与IH+sh RNA组相比,在IH+NC组及IH+Egr-1组,Egr-1m RNA及Bim m RNA表达明显升高,Beclin-1 m RNA表达明显减少。3.Western blot检测自噬关键蛋白及Egr-1/Bim/Beclin-1蛋白表达。与Con组相比,在IH组、IH+NC组及IH+Egr-1组,Egr-1、Bim及p62蛋白表达明显增加,Beclin-1及LC3II蛋白表达减少;与IH组相比,在IH+Egr-1组,Egr-1、Bim及p62蛋白表达明显增加,Beclin-1及LC3II蛋白表达减少;与IH+sh RNA组相比,在IH+NC组及IH+Egr-1组,Egr-1、Bim及p62蛋白表达明显增加,Beclin-1及LC3II蛋白表达减少。4.透射电镜观察Con组心肌细胞,线粒体形态正常,无水肿或空泡;IH组、IH+NC组及IH+Egr-1组线粒体出现水肿或者空泡化,自噬体及自噬溶酶体减少;沉默Egr-1蛋白表达可见心肌细胞自噬体及自噬溶酶体增加,线粒体水肿减轻。5.激光共聚焦显微镜检测心肌细胞自噬流,与Con组相比,IH+sh RNA组自噬流明显增强;与IH组相比,IH+sh RNA组自噬流明显增强;与IH+sh RNA组相比,IH+NC组、IH+Egr-1组及IH+sh RNA+3-MA组自噬流显著减少。6.心肌细胞凋亡检测,根据cleaved caspase 3蛋白表达及流式细胞仪检测心肌细胞凋亡显示,与Con组相比,在IH组、IH+NC组、IH+Egr-1组及IH+sh RNA+3-MA组凋亡明显增加;与IH组相比,IH+sh RNA组凋亡显著减少,IH+Egr-1组凋亡明显增加;与IH+sh RNA组相比,IH+NC组、IH+Egr-1组及IH+sh RNA+3-MA组凋亡明显增加。结论:1.IH后Egr-1/Bim/Beclin-1信号通路被激活;2.Egr-1/Bim/Beclin-1信号通路通过调节心肌细胞自噬参与IH致心肌细胞损伤。