研究背景慢性非传染性疾病(NCDs)是当今全球致死的主要原因,给人类健康及社会发展带来重大危害,其发生与生活方式、行为方式、职业和环境因素等有关,临床治疗效果并不是很理想,但其发生在很大程度上是可以预防的。其中炎症是促进NCDs发生和发展的关键危害因素。营养流行病学研究显示,食物来源的植物化学物具有抗炎、抗氧化、抗癌等多种生物活性,在NCDs的防治中具有良好应用前景。大豆皂甙是大豆及其制品中的一种五环三萜类植物化学物,近年来大豆皂甙的抗炎活性及其机理备受关注。研究显示,大豆总皂甙和SS-I在脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型中可通过抑制核转录因子κB(NF-κB)活性而减少诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)以及炎症介质一氧化氮(NO)和前列腺素2(PGE2)的产生。在LPS刺激的原代分离培养的小鼠腹腔巨噬细胞炎症模型中,同样也观察到SSA1可通过抑制NF-κB活性而减少促炎因子的产生。体内试验也表明,SS-I和SSA1可通过抑制NF-κB信号通路而减轻三硝基苯磺酸诱导的小鼠慢性结肠炎。本课题组前期运用RAW264.7小鼠巨噬细胞体外炎症模型对五种不同结构的大豆皂甙(SSA1、SSA2、SS-I、SG-A和SG-B)的抗炎活性研究发现,SSA1、SSA2和SS-I可呈浓度依赖型的抑制NF-κB活性进而抑制炎症酶和促炎细胞因子的产生。这些研究表明大豆皂甙可能会通过调控NF-κB信号通路而发挥抗炎活性。目前有关大豆皂甙抗炎活性和机理的研究正方兴未艾。目的植物化学物可通过靶向调控炎症相关信号通路抑制机体炎症(尤其是慢性炎症状态)而达到防治NCDs的效果,大豆皂甙因其抗炎等多种活性在NCDs防治方面具有潜在价值。SSBa是一种新提取的B组大豆皂甙单体,其抗炎活性及机制目前国内外尚未见报道。因此,本实验首先以LPS刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞经典体外炎症模型为参照,运用饱和脂肪酸棕榈酸(PA)建立模拟体内高游离脂肪酸炎症状态的体外巨噬细胞炎症模型；进一步运用蛋白印迹(WB)、酶联吸附免疫(ELISA)、实时荧光定量PCR (FQ-PCR)等技术研究SSBa对炎症酶和促炎细胞因子产生的影响,并进一步探讨其对NF-κB炎性信号通路的调控作用。旨在弄清SSBa的抗炎活性,初步阐明其抗炎机理,为合理利用大豆皂甙预防慢性炎症介导的NCDs提供新的思路和理论依据。方法1.MTT法测定细胞增殖与毒性25～500μmol/L PA对RAW264.7小鼠巨噬细胞进行不同时间(6、12、24、48、72 h)处理后,吸弃孔内培养上清液,加入MTT溶液,继续孵育4h后吸弃上清液加入DMSO,酶标仪测定490 nm波长处的吸光度,实验重复3次。采用SPSS软件Probit概率单位模型计算细胞增殖半数抑制浓度(IC50)。2. Western Blot检测蛋白表达量细胞培养和处理：①LPS诱导的细胞炎症模型阳性对照组的建立：0.2～2 μg/mL LPS处理6h;0.1～1μg/mL LPS处理24h。②PA诱导的细胞炎症模型的建立：50～250μmol/L PA处理6h或24 h。③SSBa干预PA诱导的细胞炎症模型：20～200μmol/L SSBa对细胞进行预孵育2h,然后用250μmol/L的PA处理6h或24 h。④NF-κB信号通路相关蛋白(p65/p-p65、IκBa/p-IκBa)的表达检测：50～250μmol/L PA处理;20～200μmol/L SSBa预孵育2h后250μmol/L的PA处理30 min。收集细胞后提取样品总蛋白,测定蛋白浓度后用PBS和5×SDSLoading Buffer按所需浓度稀释样品蛋白,加热蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育与显影,得到的蛋白条带使用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。3. FQ-PCR检测mRNA表达细胞的培养和处理：①LPS诱导的细胞炎症模型阳性对照组的建立：0.2-2μg/mL LPS处理6h; 0.1～1μg/mL LPS处理24 h。②PA诱导的细胞炎症模型的建立：50～250μmol/L PA处理6 h或24 h。③ SSBa干预PA诱导的细胞炎症模型：20～200μmol/L SSBa对细胞进行预孵育2 h,然后用250μmol/L的PA处理6h或24 h。收集细胞后用Trizol法提取总RNA,然后对样品中总RNA的浓度及纯度进行测定,通过逆转录反应将总RNA逆转录生成cDNA,测定cDNA的浓度及纯度,使用FQ-PCR试剂盒将cDNA在Real Time PCR仪上扩增出目的基因COX-2、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6,以β-actin作为内参基因,采用比较C(t)值的相对定量法,根据ΔΔCt计算出处理组与对照组之间目标基因的表达差异?-ΔΔCt4. ELISA测定TNF-a浓度0.2-2μg/mL LPS处理6h；50～250μmol/L PA处理6h;20～200μmol/L SSBa预孵育1h,然后用250μmol/L的PA处理6 h。设阴性对照组。处理时间结束后收集细胞皿内的培养基,离心后使用相应试剂盒进行ELISA测定,结合标准品标准曲线计算检测样品中的TNF-a浓度。5.台盼蓝计数法20～200μmol/L SSBa对细胞进行处理6h或24 h,载玻片上台盼蓝使用液与细胞悬液按1：1充分混合后,3 min内显微镜下观察并计数蓝染和未蓝染的细胞,统计每个样品的相对细胞抑制率和活细胞率,采用SPSS软件Probit概率单位模型计算细胞增殖半数抑制浓度(IC50)。6.统计处理结果以均数±标准差(X+SD)表示。采用统计软件SPSS 19.0分析,运用单因素方差分析进行多个样本均数比较,进行分析之前先进行方差齐性检验,如果方差齐,运用LSD法进行组间比较；如果方差不齐,运用Dunnett’s T3法进行组间比较。采用SPSS 19.0软件Probit Analysis概率单位模型计算细胞增殖半数抑制浓度。结果1.PA对RAW264.7小鼠巨噬细胞增殖活力的影响PA对RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖活力呈浓度和时间抑制效应,PA处理RAW264.7小鼠巨噬细胞6、12、24、48和72 h的IC50值分别为610.51、433.42、217.11、167.29和132.20μmol/L。结合WB实验中炎症酶的蛋白表达情况,将PA的处理浓度设定为50～250μmol/L,处理的时间设定为6h或24 h。2. SSBa对RAW264.7小鼠巨噬细胞增殖活力的影响SSBa对RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖活力呈浓度和时间抑制效应,SSBa处理RAW264.7小鼠巨噬细胞6 h和24 h的ICso值分别为4139.03μmol/L和4020.76μmol/L,表明其毒性较小。本实验将SSBa的干预浓度设定为20、50、100和200μmol/L,预孵育的时间为1h或2 h。3.LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞建立炎症模型0-2μg/mL的LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞6h或24 h,炎症酶(COX-2和iNOS) mRNA和蛋白表达水平以及促炎细胞因子(TNF-a、IL-1β和IL-6)的mRNA表达水平均呈浓度依赖性显著升高(P<0.05)。LPS刺激6 h后TNF-a在细胞培养上清中分泌量显著升高(P<0.01)。4.PA刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞建立炎症模型50～250μmol/L PA处理6h或24 h,可呈浓度依赖性显著增加炎症酶(COX-2和iNOS)的mRNA与蛋白表达水平(P<0.01)、促炎细胞因子(TNF-a、IL-1β、 IL-6)的mRNA表达水平(P<0.05)。PA刺激6h后TNF-a在细胞培养上清中分泌量呈浓度依赖性显著升高(P<0.01)。5. SSBa对PA诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症反应的影响SSBa预孵育可显著抑制PA引起的炎症酶(COX-2和iNOS)蛋白与mRNA表达水平以及促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6) mRNA表达水平的增高(P<0.01)。SSBa预孵育可呈浓度依赖性抑制PA刺激的细胞培养上清中TNF-a分泌(P<0.01)。6. SSBa对PA诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞中NF-κB炎性信号通路的影响250μmol/L PA刺激5 min可使p65磷酸化开始增强,到30 min时磷酸化增至表达高峰。不同浓度PA处理30 min,p65总蛋白含量无改变(P>0.05),但p-p65呈浓度依赖性上升(P<0.01)。不同浓度SSBa预孵育1h,再用250μmol/LPA刺激30 min,p65总蛋白含量无显著改变(P>0.05),100和200μmol/L SSBa可显著抑制PA引起的p-p65蛋白表达量增加(P<0.05)；PA显著抑制IKBa水平(P<0.01),20～100μmol/L SSBa可拮抗PA引起的IκBa表达量下降(P<0.01)；PA显著增高p-IκBa水平(P<0.01),而50～200μmol/L SSBa可抑制p-IκBa水平(P<0.01)。结论1.以炎症酶(iNOS和COX-2)和促炎细胞因子(TNF-a、IL-1β和IL-6)作为炎症发生发展的指标,PA刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞可建立与经典刺激因子LPS相似的体外炎症模型。2.在PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型中,SSBa可抑制炎症酶(iNOS和COX-2)的mRNA和蛋白表达、促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的mRNA表达以及抑制TNF-a的分泌。3.在PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型中,SSBa能抑制IkBα的磷酸化和泛素化降解以及NF-κB p65的磷酸化。