马鞭草为马鞭草科(Verbenaceae)植物马鞭草Verbena officinalis L.的干燥地上部分,具有活血散瘀,截疟,解毒,利水消肿的功效。《Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals》记载,在民间该药常常被用作利尿药、祛痰药和抗风湿药,在西班牙的Navarra地区,该药广泛用于抗炎。桂承会等于1985年报道马鞭草水煎剂有一定镇咳作用,并证明马鞭草苷的镇咳作用与水煎剂基本一致。一般而言,中药发挥药效作用的物质基础多为一类或几类物质成分,马鞭草苷为马鞭草所含成分之一,与其同类的其他成分也有很多,是否发挥镇咳作用的为包括马鞭草苷在内的糖苷类物质呢?本文通过研究马鞭草提取液及分取液的镇咳活性,寻找其药效物质基础,在此基础上,分离确定马鞭草有效部位的化学成分,并对主要活性物质的含量、在动物体内的吸收、分布等情况进行探讨,为马鞭草的开发利用奠定基础。第一部分马鞭草镇咳作用的研究目的:研究马鞭草镇咳作用及有效部位,明确马鞭草镇咳作用的药效物质基础。方法:观察马鞭草总提物及分取部位对小鼠因氨水所致咳嗽以及对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响;利用豚鼠因枸橼酸所致咳嗽试验对不同剂量的马鞭草提取物的镇咳和咳嗽潜伏期进行考察;利用小鼠呼吸道酚红排痰量试验研究马鞭草提取物的祛痰作用;探讨马鞭草提取物对磷酸组胺、氯化乙酰胆碱、氯化钾所致豚鼠离体气管痉挛的影响,分析其作用机制。结果:与对照组比较,马鞭草水提物、马鞭草醇提物、乙酸乙酯分取液、正丁醇分取液能明显减少小鼠咳嗽次数,显示出一定的镇咳效果,显著延长浓氨水诱发小鼠咳嗽潜伏期;与对照组比较,马鞭草水提物、马鞭草醇提物、石油醚分取液、氯仿分取液、乙酸乙酯分取液、正丁醇分取液能明显抑制小鼠耳朵的肿胀度,显示出一定的抗炎效果;与对照组相比,马鞭草提取物小、中、大剂量明显减少豚鼠咳嗽次数,显示出一定的镇咳效果并能显著延长枸橼酸诱发豚鼠咳嗽潜伏期;与对照组相比,马鞭草醇提物能明显增加酚红气道排泄量,马鞭草醇提物显示出一定的祛痰作用;不同剂量的马鞭草醇提物对磷酸组胺引起的离体气管平滑肌痉挛均有一定程度的抑制作用,而对氯化乙酰胆碱和氯化钾引发气管平滑肌痉挛没有作用。结论:药效学研究结果表明,马鞭草能够抑制浓氨水所致小鼠咳嗽、枸橼酸所致豚鼠的咳嗽反应,并有明显的祛痰、对抗二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的作用,能够显著地对抗磷酸组胺所致的豚鼠离体气管平滑肌痉挛。马鞭草的正丁醇部位和乙酸乙酯部位为发挥药效作用的主要物质基础。第二部分马鞭草镇咳有效部位化学成分的研究目的:本研究以马鞭草正丁醇和乙酸乙酯部分为研究对象,利用硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶色谱、制备薄层色谱、高效液相制备色谱以及重结晶等分离纯化技术对其进行分离研究,寻找含有的化学成分,并应用MS、1H-NMR、13C-NMR现代化手段完成单体化合物分子的结构鉴定,为进一步开发利用提供依据。方法:干燥的马鞭草(10 kg)适当粉碎后,用95%乙醇冷浸二次,浸出液加热,加入活性炭趁热抽滤,合并滤液减压浓缩至粘膏状(520 g),将其悬浮于饱和NaCl水溶液中,分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取,继而得到石油醚部位(11 g)、氯仿部位(39 g)、乙酸乙酯部位(52 g)和正丁醇部位(118 g)。本研究先后对乙酸乙酯部位和正丁醇部位采用硅胶柱色谱进行初步分离,经薄层色谱检识后,进一步用硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶色谱、制备薄层色谱、高效液相制备色谱反复分离纯化得到单体化合物。运用MS、1H-NMR、13C-NMR波谱学方法进行结构鉴定。结果:通过系统提取分离马鞭草,从中得到12个单体化合物,包括6个黄酮化合物,4个环烯醚萜苷类化合物,1个苯丙素糖苷,1个甾醇。结论:本文对马鞭草的化学成分进行了研究,所选用的提取方法及提取溶剂适当,采用了硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶色谱、制备薄层色谱、制备液相色谱等分离手段,共分离得到12个化合物,并且运用多种现代波谱手段及其相关知识进行了结构鉴定,包括6个黄酮化合物,4个环烯醚萜苷类化合物,1个苯丙素糖苷,1个甾醇:山奈素,芹菜素,异鼠李素,4’-羟基汉黄芩素,槲皮苷,木犀草素,马鞭草苷,戟叶马鞭草苷,桃叶珊瑚苷,龙胆苦苷,毛蕊花糖苷,β-谷甾醇。第三部分马鞭草主要糖苷含量测定的研究目的:建立HPLC/VWD法同时测定马鞭草中马鞭草苷和戟叶马鞭草苷以及利用HPLC/MS/MS法同时测定马鞭草中桃叶珊瑚苷、马鞭草苷、戟叶马鞭草苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷的含量的方法,以控制该药材的质量。方法:取马鞭草药材粉末约0.5 g,精密称定,加入80%甲醇20ml,密塞,称定重量,超声处理45 min,放冷,称重,用80%甲醇补充减失的重量,摇匀,0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,进样测定。HPLC/VWD法采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm , 5μm) ,乙腈-水(15∶85)为流动相,检测波长为238 nm。HPLC/MS/MS法采用色谱柱Waters SunfireTM C1(8150 mm×4.6 mm, 5μm),以乙腈-0.1%甲酸溶液(25:75→40:60)(0→6 min)为流动相进行梯度洗脱,流速0.8 ml/min,进样量5μl。结果:对于HPLC/VWD法马鞭草苷、戟叶马鞭草苷在17.2～155.2μg/mL和25.5～229.9μg/mL的浓度范围内与峰面积均呈良好的线性关系;平均回收率分别为98.89%(RSD=1.1%)、99.00%(RSD=0.4%)。对于HPLC/MS/MS法,桃叶珊瑚苷、马鞭草苷、戟叶马鞭草苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷五种组分的线性关系均良好(r2>0.995),平均回收率分别为:101.2%、98.63%、99.45%、101.6%、100.3%,精密度和重复性均良好。结论:本部分利用HPLC/VWD法建立了同时测定马鞭草中马鞭草苷和戟叶马鞭草苷含量的方法,并利用HPLC/MS/MS建立了马鞭草中马鞭草苷、戟叶马鞭草苷、桃叶珊瑚苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷同时测定的方法,二者均有较高的专属性、灵敏度,具有较好的精密度和准确度,能够满足马鞭草药材质量控制的要求。第四部分马鞭草苷和戟叶马鞭草苷药代动力学与组织分布的研究目的:建立高效液相色谱法测定大鼠血浆中马鞭草苷和戟叶马鞭草苷浓度的方法,并研究马鞭草苷和戟叶马鞭草苷单体以及马鞭草提取物单次给药后在大鼠体内的药代动力学过程;研究马鞭草苷和戟叶马鞭草苷在大鼠体内的组织分布。方法:大鼠以灌胃给予马鞭草苷和戟叶马鞭草苷单体以及马鞭草提取物,分别于给药后30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 min内眦动脉取血,置于肝素化塑料离心管中,样品预处理采用甲醇沉淀蛋白后氮气吹干,水复溶,利用HPLC内标法(芍药苷),色谱柱为反相C18柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-水(15:85),流速为1.0mL·min-1,检测波长238nm;取大鼠随机分为6组,灌胃给予马鞭草苷和戟叶马鞭草苷单体以及马鞭草提取物后,于60、180、300 min分别放血处死,取心、肝、肺、脾、肾、脑、胃和肠,经生理盐水冲洗,去除少量的淤血或组织内容物,并用滤纸吸去水分,称重后于匀浆器中制成500mg·mL-1的生理盐水匀浆,采用甲醇沉淀蛋白后氮气吹干水复溶的方法,利用HPLC法(同上方法)测定组织中的马鞭草苷和戟叶马鞭草苷含量。结果:血浆中马鞭草苷和戟叶马鞭草苷的线性范围31.2～625、20.3～812.5 ng·mL-1,定量下限为31.2、20.3 ng·mL-1,马鞭草苷31.2、125、625 ng·mL-1三种浓度的日内、日间精密度(RSD)分别为5.64%~7.18%和4.89%~8.99%,准确度(RE)为-1.0%~9.5%,戟叶马鞭草苷20.3、162、812.5 ng·mL-1三种浓度的日内、日间精密度(RSD)分别为0.53%~5.62%和0.59%~4.98%,准确度(RE)为-0.3%~9.5%,稳定性研究结果表明样品稳定。大鼠单次按马鞭草苷40 mg·kg-1、戟叶马鞭草苷52 mg·kg-1分别灌胃马鞭草苷、戟叶马鞭草苷单体和马鞭草提取物后,马鞭草苷、戟叶马鞭草苷的AUC及Cmax明显高于马鞭草提取物。对于马鞭草苷,给予单体后的AUC值是马鞭草提取物的1.41倍(38591.6 ng/ml/min对27177.5 ng/ml/min),对于戟叶马鞭草苷,则为1.35倍(51266.8 ng/ml/min对37885.7 ng/ml/min)。大鼠灌胃按马鞭草苷40 mg·kg-1和按戟叶马鞭草苷52 mg·kg-1给予马鞭草苷、戟叶马鞭草苷单体和马鞭草提取物后,马鞭草苷和戟叶马鞭草苷在大鼠体内经历了一个广泛而快速的分布过程,即在第一个检测时间60 min就能在各组织中发现马鞭草苷和戟叶马鞭草苷,但是它们主要分布在胃、肝、心、小肠及脾。在脑中的分布显示出马鞭草苷和戟叶马鞭草苷能透过血脑屏障。结论:灌胃后马鞭草苷和戟叶马鞭草苷单体生物利用度明显高于马鞭草提取物中的马鞭草苷和戟叶马鞭草苷;马鞭草苷和戟叶马鞭草苷主要分布在胃、肝、心、小肠及脾。在脑中的分布表示马鞭草苷和戟叶马鞭草苷能透过血脑屏障。在所研究的组织中,未见明显的特殊蓄积现象。第五部分马鞭草苷和戟叶马鞭草苷血浆蛋白结合率的测定目的:建立马鞭草苷和戟叶马鞭草苷在大鼠血浆、人血浆和牛血清白蛋白中蛋白结合率的测定方法,并计算不同种属血浆蛋白的相关参数。方法:采用平衡透析法测定血浆蛋白结合率,用高效液相色谱法测定血浆中药物总浓度及游离的药物浓度。结果:马鞭草苷的血浆蛋白结合率分别为:大鼠血浆:15.42±12.8%、17.27±12.6%、12.69±4.1%;人血浆:30.53±3.6%、13.59±8.8%、24.09±7.3%;牛血清白蛋白:20.45±7.2%、17.24±10.8%、16.89±6.0%。戟叶马鞭草苷的血浆蛋白结合率分别为:大鼠血浆:20.91±3.9%、25.60±5.4%、19.52±4.7%;人血浆:24.30±7.6%、21.76±6.5%、23.12±5.7%;牛血清白蛋白:26.19±5.6%、27.70±9.1%、25.83±7.0%。结论:本文应用平衡透析法研究了马鞭草苷和戟叶马鞭草苷与人血浆蛋白、牛血清白蛋白和大鼠血浆蛋白的结合情况,结果表明马鞭草苷和戟叶马鞭草苷的血浆蛋白结合率较低,属低血浆蛋白结合率药物,大部分药物分子以游离形式发挥药效,并且不具有浓度依赖性,不易引起具有药理作用的游离型血药浓度发生明显变化,说明马鞭草苷和戟叶马鞭草苷临床用药有较好的安全性。第六部分马鞭草苷和戟叶马鞭草苷大鼠在体肠吸收动力学的研究目的:建立同时测定肠循环液中马鞭草苷或戟叶马鞭草苷与酚红浓度的HPLC/DAD法,探讨马鞭草苷和戟叶马鞭草苷在大鼠各肠段的吸收动力学特征及不同药物浓度对其的影响。方法:采用大鼠在体肠吸收实验方法,以HPLC/DAD法测定肠循环液中药物的含量,色谱条件为:Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm);柱温30℃;流动相为乙腈:0.05%磷酸溶液,梯度洗脱,流速1.0 mL/min;检测波长238 nm(马鞭草苷或戟叶马鞭草苷)和430 nm(酚红);进样量20μL。结果:在0.05～0.20 mg/mL浓度内马鞭草苷或戟叶马鞭草苷的吸收量与浓度成线性关系,Ka值基本保持不变;马鞭草苷和戟叶马鞭草苷各肠段的吸收速率无显著性差异,马鞭草苷在十二指肠、空肠、回肠、结肠的Ka值分别为(0.0536±0.0062),(0.0504±0.0051),(0.0523±0.0037),(0.0492±0.0023)h-1;戟叶马鞭草苷在十二指肠、空肠、回肠和结肠的Ka值分别为(0.0405±0.0039),(0.0365±0.0032),(0.0379±0.0045)和(0.0349±0.0037)h-1。结论:本文首次建立了HPLC/DAD法同时测定肠循环液中马鞭草苷或戟叶马鞭草苷及酚红的浓度的方法,该法操作简便,结果准确,灵敏度高。研究结果表明,马鞭草苷和戟叶马鞭草苷在肠道的吸收呈现一级动力学过程,且吸收机制为被动扩散;马鞭草苷和戟叶马鞭草苷在整个肠道均有吸收,可以将马鞭草苷或戟叶马鞭草苷研制成缓释制剂。