磺酸化甲壳素和磺酸化壳聚糖的生物学功能和安全性研究

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目的:甲壳素、壳聚糖糖残基上羟基能与含氧无机酸发生酯化反应,氨基上也可发生酯化反应。在甲壳素、壳聚糖的众多酯化反应中,研究最多的是两者的硫酸酯化反应。酯化产物磺酸化甲壳素(S-CT)、磺酸化壳聚糖(S-CTS)具有良好的水溶性、成膜性、生物降解性等,在轻工业、食品、医药、农业等领域具有广泛的应用前景。已有研究表明S-CT、S-CTS具有抗凝血、抗血栓、抗氧化、抗病毒、抗动脉硬化、抗肿瘤等多种生物学活性,但对其生物安全性评价甚少。本论文通过磺化反应分别合成S-CT、S-CTS,旨在研究S-CT、S-CTS的生物安全性,探讨其抗凝效果,对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)体外生长影响,以及对人宫颈癌细胞HeLa、人喉表皮样癌HEp-2细胞、人胃癌细胞SGC-7901体外生长的影响,为S-CT、S-CTS安全性应用提供实验依据。方法:1、通过甲壳素/壳聚糖的羟基(尤其是C6-OH)与磺化剂(氯磺酸/浓硫酸混酸)发生低温非均相酯化反应合成磺酸化甲壳素(S-CT)/磺酸化壳聚糖(S-CTS)。分别对S-CT、S-CTS进行纯化及理化性质测定。2、通过兔皮内刺激反应,评价两种材料对机体的短期刺激反应强度;以胶体、膜片为载体,分别评价两种材料的皮下、肌肉组织相容性及体内降解性;通过溶血率测定,评价两种材料的血液相容性。3、通过全血凝血试验研究S-CT、S-CTS体外抗凝血功能,在细胞水平,采用显微观察结合MTT法评价S-CT、S-CTS对人血管内皮细胞HUVEC、人宫颈癌细胞HeLa、人喉表皮样癌HEp-2细胞以及人胃癌细胞SGC-7901体外生长的作用结果:1、红外图谱显示两种材料均发生磺化取代,测定两者均具有较高取代度。2、两种材料皮内刺激反应结果均符合国家要求,表现出良好的血液相容性。胶体在体内降解极快,炎症反应极轻微。膜片在体内呈线性速率降解,炎症反应随时间逐渐减轻,两种材料整体表现出良好的生物组织相容性以及体内降解性。3、S-CT、S-CTS在2.5-10mg/mL浓度范围内,均具有明显的抗凝作用,其中S-CTS的抗凝效果优于S-CT。两种材料在125-250μg/mL浓度范围内对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)体外生长有一定的促进作用,其中以250mg/mLS-CT,作用2d,促进效果最为显著。两种材料在62.5-1000μg/mL浓度范围内对人宫颈癌细胞(HeLa)、人喉表皮样癌细胞(HEp-2)、人胃癌细胞(SGC-7901)的体外增殖都有显著抑制作用,S-CT对三种癌细胞最大抑制率分别可达到48.52%(6d)、35.73%(6d)、57.43%(6d),S-CTS对三种癌细胞最大抑制率分别可达到65.23%(6d)、43.19%(6d)、44.32%(4d),并且基本遵循抑制率随着作用时间的增加、浓度的增加而增加这个趋势,呈现一定的量效关系。结论:两种材料均具有良好的生物相容性,体内降解性良好,各项指标均符合国家对安全性实验的要求。在生物学功能方面,表现为抗凝效果显著;对正常人脐血管内皮细胞(HUVEC)体外生长有一定促进作用;对肿瘤细胞:HeLa细胞、HEp-2细胞、SGC-7901细胞体外生长有明显抑制作用,为两种材料的进一步生物学功能的研究以及今后可能的运用提供一定依据。
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