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第一部分含IL-24的培养体系对CIK细胞生物学活性的影响目的:观察IL-24对CIK细胞生物学活性的影响,探寻增强CIK细胞毒活性的有效方法。方法:分离人外周血单个核细胞,用含有或不含IL-24的培养体系体外诱导培养CIK细胞,观察细胞增殖情况,FCM和ELISA法分析CIK表型及分泌细胞因子能力的差别,溶血试验和FCM法评价CIK细胞产生颗粒酶等毒性颗粒和IFN-γ的能力,将培养获得的CIK细胞和白血病细胞共培养,MTT法和FCM法检测各组CIK细胞对白血病细胞的细胞毒活性。结果:成功诱导培养获得CIK细胞,CIK细胞呈集落样生长,增殖速度较快,未添加IL-24的对照组CIK细胞的增殖率高于添加IL-24培养组。与对照组相比,培养体系中添加IL-24后CIK细胞中CD3+、CD4+和CD3+CD56+细胞的比例无明显改变,而CD3+CD8+、CD8+CD62L+和CD8+CCR7+细胞的数量呈一定程度增加,同时CD4+CD25+CD127-细胞比例有所下降。IL-24可上调CIK细胞表面CD107a和CD54分子以及胞内颗粒酶B的表达,此外,IL-24还可使CIK细胞分泌TNF-α和IFN-γ的能力显著增强。诱导培养的各组CIK细胞均能不同程度诱导K562、K562/A02及新鲜分离的原代白血病细胞凋亡,IL-24组的CIK细胞比常规方法培养的CIK细胞的肿瘤杀伤活性更强。结论:成功从健康人外周血单个核细胞中诱导培养了CIK细胞,所获得的CIK细胞具有正常的生物学功能。IL-24可通过增加CD3+CD8+细胞和中央型记忆T细胞(CD8+TCM)的数量,上调CIK细胞表面粘附分子、CD107a和胞内颗粒酶等毒性颗粒的表达,以及促进CIK细胞分泌Th1型细胞因子,减少CIK细胞中Treg调节性T细胞的比例等途径来改变CIK细胞的生物学特性,增强CIK细胞的抗肿瘤作用。第二部分il-24基因修饰的树突细胞促进cik细胞对白血病细胞的杀伤作用目的:研究cik细胞与il-24基因修饰的同源树突状细胞共培养后对白血病细胞的杀伤作用及其作用机理。方法:从外周血单个核细胞中常规诱导培养dc和cik细胞,同时构建重组腺病毒载体advgfp/il-24(ad-il-24),将il-24基因通过重组病毒导入已负载肿瘤抗原的dc,所构建的细胞称为dc-il-24,rt-pcr和elisa法检测dc-il-24中il-24基因的表达。重组病毒感染72h后在培养体系中加入il-10,fcm和elisa法分别检测dc表型和细胞因子分泌能力的变化,将各组dc和cik细胞混合培养,fcm法检测与dc共培养的cik细胞对白血病细胞杀伤活性的变化。结果:成功从健康人外周血单个核细胞中诱导培养了dc和cik细胞,重组腺病毒ad-il-24能有效将il-24基因导入dc,il-24可上调dc表面cd80、cd83、hla-dr、cd40、cxcr4分子的表达。基因转染后的dc分泌il-12、tnf-α的能力显著提高。il-10能够抑制dc表型成熟,促使其向单核-巨噬细胞方向分化,并降低dc分泌il-12、tnf-α的能力,但il-10对已转入il-24基因的dc并无明显抑制作用。cik细胞与dc-il-24共培养后对白血病细胞的细胞毒活性明显增强,且这种作用不受il-10的抑制。结论:通过重组病毒将il-24基因导入dc后,il-24基因的表达能有效活化dc,促进dc表型成熟,分泌th1型细胞因子,进而增强共培养的cik细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用,且这种转基因dc能抵抗il-10的免疫抑制作用。第三部分rgd修饰的il-24重组腺病毒载体对髓系白血病目的:构建rgd修饰的il-24重组腺病毒载体,观察它对白血病细胞的抑制效应及其作用机制。方法:构建重组腺病毒ad.rgd-il-24,观察它对髓系白血病细胞thp-1、k562、k562/a02、meg-01的感染效率,瑞氏-姬姆萨染色和fcm检测白血病细胞的分化情况。mtt法检测重组腺病毒对白血病细胞生长的影响,流式细胞仪检测il-24基因表达对白血病细胞周期和凋亡的影响。real-timepcr和westernblot法检测转染il-24基因后细胞凋亡相关基因grp78/bip、gadd153、gadd34、gadd45α、bax、bcl-2和mcl-1在thp-1细胞中的表达,分光光度法检测caspase-3活性的变化。结果:我们成功构建并获得rgd修饰的重组腺病毒载体ad.rgd-il-24,ad.rgd-il-24对meg-01等髓系白血病细胞的感染效率较高。异位过表达il-24能通过细胞周期阻滞来抑制靶细胞生长,并对髓系白血病细胞有一定诱导分化的作用。ad.rgd-il-24重组腺病毒能显著诱导thp-1细胞凋亡,但不能明显诱导k562和k562/a02细胞凋亡。ad.rgd-il-24能明显上调thp-1细胞grp78/bip、gadd153、gadd34、gadd45α和bax基因的表达,并下调bcl-2和mcl-1基因的表达,同时增强caspase-3的活性。结论:rgd修饰的重组腺病毒载体ad.rgd-il-24对某些种类的髓系白血病细胞具有较高的基因转导能力,内源性il-24的过表达可明显抑制白血病细胞生长,并一定程度地诱导分化。ad.rgd-il-24能通过调节凋亡相关蛋白的表达,诱导thp-1细胞凋亡。第四部分il-24基因表达对髓系白血病细胞的免疫调变作用目的:观察il-24基因表达对髓系白血病细胞免疫原性的调变作用。方法:为观察il-24对髓系白血病细胞的免疫调变作用,fcm检测il-24对白血病细胞表面cd80、cd86、hla-abc、hla-dr、mica/b、cd137、cd137l、cd200等免疫分子表达的影响,elisa检测ad.rgd-il-24对白血病细胞分泌vegf、tnf-α、il-6和il-8细胞因子的影响,细胞毒试验检测白血病细胞感染重组病毒后对cik细胞毒敏感性的变化。体内成瘤试验观察转基因白血病细胞在裸鼠体内的生长和成瘤情况,免疫组织化学法检测vegf、cd31、cd34、collageniv、cd147、mt1-mmp、mmp-2和mmp-9等因子的表达。结果:髓系白血病细胞低表达上述分子,而IL-24可影响部分免疫分子的表达,并对白血病细胞分泌某些与免疫相关的细胞因子具有一定的调节作用。IL-24基因修饰可提高白血病细胞对免疫杀伤细胞的敏感性,并抑制裸鼠白血病细胞移植瘤的生长。分子机制检测结果显示:Ad.RGD-IL-24重组腺病毒能明显下调与肿瘤血管生成密切相关的蛋白分子VEGF、CD31、CD34和collagen IV的表达,同时下调肿瘤侵袭相关分子CD147和基质金属蛋白酶MT1-MMP、MMP-2和MMP-9的表达。结论:IL-24对髓系白血病细胞的免疫原性具有调变作用,能增加白血病细胞对CIK细胞体外杀伤作用的敏感性,还能通过抑制肿瘤血管生成和降低其侵袭性,抑制裸鼠白血病细胞移植瘤的生长。