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目的研究microRNA-21(miR-21)在小鼠碱烧伤诱导角膜新生血管(corneal neovascularization,CorNV)形成中的作用,及miR-21抑制剂antagomiR-21对CorNV的影响,为进一步阐明CorNV的发病机制和探索CorNV治疗的新方法提供实验基础。方法(1)miR-21在小鼠碱烧伤CorNV模型中的表达分析。取85只清洁级BALB/c小鼠,使用浸有1mol/L NaOH溶液的2mm单层圆形滤纸片烧灼右眼角膜中央30s,为模型组;左眼不予处理,为对照组。碱烧伤后4d、7d、14d、21d、28d行眼前节照相观察CorNV大体形态变化并计算CorNV面积。分别于碱烧伤后4d、7d、14d、28d取材制作石蜡切片,行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察角膜组织结构及CorNV病理变化;免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)染色检测角膜血小板-内皮细胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31)并计数新生血管,低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)蛋白表达。使用Illumina miRNA测序技术检测碱烧伤后0d、4d、7d角膜miRNAs表达谱。实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测碱烧伤后4d、7d、14d、28d角膜miR-21及HIF-1αmRNA、VEGF-A mRNA表达。(2)AntagomiR-21抑制小鼠碱烧伤CorNV作用研究。取90只清洁级BALB/c小鼠,右眼制备角膜碱烧伤CorNV模型,左眼不予处理。后随机将小鼠分为5组,每组18只,于碱烧伤后2d、8d时分别球结膜下注射0.9%生理盐水(阴性对照组)、5nmol scrambled sequence(antagomiR-negative control治疗组)、1nmol antagomiR-21(antagomiR-21低剂量治疗组)、5nmol antagomiR-21(antagomiR-21高剂量治疗组)、2nmol Ranibizumab(阳性对照组)。碱烧伤后4d、7d、14d时行眼前节照相观察CorNV形态学变化并计算CorNV面积;分别于碱烧伤后7d、14d时行HE染色观察角膜组织结构及CorNV变化;IHC染色检测角膜CD31表达并计数新生血管,HIF-1α、VEGF-A蛋白表达;Real-time PCR检测角膜miR-21及HIF-1αmRNA、VEGF-A mRNA表达。结果(1)碱烧伤后14d时,小鼠CorNV达生长高峰,面积增至最大;HE染色和CD31染色显示角膜基质中可见粗大、致密新生血管;其后CorNV消退。miRNA测序显示碱烧伤后4d、7d时角膜有19个miRNAs表达显著高于或低于0d时(变化2倍及以上),其中miR-21分别上调约6.84倍、6.27倍。Real-time PCR检测和IHC染色显示角膜miR-21、HIF-1α(mRNA和蛋白)、VEGF-A(mRNA和蛋白)表达高于0d时,差异均有统计学意义(P<0.05),且均于7d时达高峰。碱烧伤后小鼠角膜miR-21与HIF-1α(mRNA和蛋白)、miR-21与VEGF-A(mRNA和蛋白)表达变化均呈正相关。(2)眼前节照相、HE染色及CD31染色结果显示:碱烧伤后7d、14d时5nmol antagomiR-21组、Ranibizumab组较生理盐水组角膜新生血管减少,细小稀疏,CorNV面积及新生血管数明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR结果显示:与生理盐水组比较,5nmol antagomiR-21组角膜miR-21、HIF-1αmRNA、VEGF-A mRNA相对表达于7d、14d时均降低;1nmol antagomiR-21组角膜miR-21、HIF-1αmRNA相对表达于7d时降低,VEGF-A mRNA相对表达于14d时降低;Ranibizumab组角膜miR-21、VEGF-A mRNA相对表达于7d、14d时均降低,7d时HIF-1αmRNA相对表达降低;差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果显示:与生理盐水组比较,7d、14d时5nmol antagomiR-21组角膜HIF-1α和VEGF-A蛋白表达均降低;而1nmol antagomiR-21组VEGF-A蛋白仅于7d时表达降低,Ranibizumab组VEGF-A蛋白表达于7d、14d时均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);HIF-1α表达未明显改变。结论(1)miR-21、HIF-1α、VEGF-A在碱烧伤诱导小鼠CorNV模型中表达上调,且miR-21与HIF-1α、VEGF-A表达呈正相关,miR-21可能促进CorNV的形成。(2)球结膜下注射适量的miR-21拮抗剂antagomiR-21可通过下调HIF-1α、VEGF-A表达抑制碱烧伤诱导的小鼠CorNV形成。(3)miR-21通过HIF-1α/VEGF-A信号通路参与调控碱烧伤诱导小鼠CorNV形成并发挥促进作用,antagomiR-21有望成为一种角膜新生血管治疗的潜在新手段。