木霉诱导黄瓜对灰霉病的系统抗性及其机理研究

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木霉(Trichoderma spp.)是一种重要的生防真菌,在农作物病害的生物防治中起着举足轻重的作用。大量研究表明,木霉的拮抗机制具有多样性,除了对许多病原菌具有竞争作用、重寄生作用和抗生作用,并有研究指出木霉具有诱导植物产生系统抗病性的作用。目前,有关木霉诱导抗性机制的研究已经取得了一定进展,但是还不够完善。深入研究木霉的诱导抗性机制有助于构建高效的生防木霉菌株,生产出效果优良的木霉菌剂,从而更有利于植物病害的防治。因此,本研究论文通过生物模型筛选出具有诱导植物产生系统抗性能力的木霉菌株,并进行鉴定,对其防病机理进行了研究,初步构建了木霉诱导抗性体系。本文采用植物生测法从本实验室保存的具有拮抗作用的木霉菌株中筛选出对黄瓜灰霉病具有诱导系统抗性的菌株。研究结果显示:不同木霉菌株诱导处理黄瓜幼苗根部后,对黄瓜灰霉病(叶面病害)的相对防病效果存在显著性差异。其中,木霉Tr-28和Tr-92两株木霉的相对防病效果最好,分别达到了53.7%和56.0%,说明这两株菌对黄瓜灰霉病具有较强的诱导系统抗性的作用。通过形态学观察和ITS rDNA分子学鉴定方法对上述两株木霉菌株进行菌种鉴定,结合两种鉴定方法,得出木霉Tr-28和Tr-92在形态学上与木霉属一致,Tr-92与Trichoderma atroviride的亲缘关系很近,鉴定该株菌为Trichoderma atroviride,而木霉Tr-28鉴定为木霉属。木霉Tr-28和Tr-92诱导处理黄瓜幼苗根部后,测定诱导处理不同时间后黄瓜叶片、茎、根不同组织部位中POD、PPO、PAL、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的酶活性变化。结果显示:处理组中黄瓜幼苗不同组织部位中POD、PPO、PAL、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性均显著高于对照组。其中Tr-28诱导处理黄瓜幼苗叶片组织中POD、PPO、PAL、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性的峰值分别是对照处理的1.86、1.00、2.94、1.11、1.02倍;茎组织中POD、PPO、PAL、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性的峰值分别是对照处理的1.00、1.15、2.01、2.66、1.17倍;根组织中POD、PPO、PAL、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性的峰值分别是对照处理的1.30、1.18、1.50、1.18、1.02倍。Tr-92诱导处理黄瓜幼苗叶片组织中POD、PPO、PAL、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性的峰值分别是对照处理的3.61、1.44、3.94、1.34、1.39倍,茎组织中POD、PPO、PAL、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性的峰值分别是对照处理的3.11、1.65、2.12、1.38、1.31倍;根组织中POD、PPO、PAL、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性的峰值分别是对照处理的1.37、1.70、2.23、1.23、1.01倍。通过比较两株木霉对黄瓜幼苗不同组织部位中相关防御酶系及其病程相关蛋白酶的诱导作用,木霉Tr-92具有相对稳定的诱导作用。通过对黄瓜叶片中POD同工酶和病程相关蛋白(PRS)电泳图谱分析,得知木霉Tr-92诱导处理黄瓜根部后,黄瓜叶片中POD同工酶和病程相关蛋白的表达量发生了变化。结果表明,在木霉Tr-92诱导作用下,黄瓜叶片中出现了POD同工酶的新酶带,并且主酶带的颜色和带型比对照组加深加宽,说明木霉Tr-92处理黄瓜根部,能够诱导黄瓜叶片中POD同工酶表达量的增加;诱导处理后黄瓜叶片中病程相关蛋白条带增多,表明木霉Tr-92能够诱导黄瓜体内潜在的防御基因的表达。通过对黄瓜根细胞的超微结构进行透射电镜观察,结果表明:木霉Tr-92能够穿透根的表皮细胞,进入细胞排列紧密的内皮层,在黄瓜根组织表皮组织中细胞生存,使细胞壁中木质素和胼胝质物质大量积累,增强了细胞对外界病原菌的抵抗能力,从而减少了病原菌对其的侵害作用。通过研究不同浓度木霉孢子悬浮液诱导、不同的施入方式及不同诱导间隔时间等因素对木霉诱导黄瓜抗灰霉病能力的影响,初步构建木霉诱导黄瓜抗灰霉病的技术体系,结果表明,在黄瓜幼苗一叶一心期根部接种浓度为106cfu/mL木霉孢子悬浮液3d后进行挑战接种灰葡萄孢病原菌,黄瓜幼苗的抗病能力最强。
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