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目的:基于AMPK靶点在细胞水平及动物水平上探讨美洲大蠊多肽PAE2逆转肝癌多药耐药细胞BEL-7402/5-FU的作用及其机制研究。方法:(1)以人肝癌敏感BEL-7402细胞和人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/5-FU为试验对象,ELISA法检测美洲大蠊多肽PAE2对细胞内AMPK含量的影响。RT-PCR法检测美洲大蠊多肽PAE2对细胞中AMPK m RNA含量的影响。(2)噻唑蓝法(MTT)测定AMPK激活剂AICAR作用时间及浓度。(3)划痕试验检测BEL-7402细胞、BEL-7402/5-FU细胞的侵袭转移能力以及美洲大蠊多肽PAE2对耐药细胞侵袭转移能力的影响。(4)RT-PCR法检测美洲大蠊多肽PAE2对细胞中侵袭转移相关因子MMP2,MMP9,m TOR,AKT,4EBP1 m RNA含量的影响。(5)激光共聚焦显微镜观察多肽PAE2对细胞自噬流LC3B的影响。(6)免疫细胞化学法(ICC)检测美洲大蠊多肽PAE2对细胞自噬相关蛋白P62的影响。(7)RT-PCR检测美洲大蠊多肽PAE2对自噬相关因子ATG5,ATG7,BECLIN,PIK3C3,LC3B,P62等m RNA的影响。(8)以Balb/c-nude为试验对象,裸鼠腋下接种人肝癌BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型。给予相应受试药物14天,观察裸鼠一般状态。裸鼠每天称重,隔天用游标卡尺记录肿瘤长径和短径,计算瘤体积。(9)裸鼠取材计算脏器指数及肿瘤重量。(10)裸鼠眼球取血,进行生化指标测定。(11)H&E染色观察多肽PAE2对裸鼠皮下移植瘤肿瘤组织及肝组织病理学的影响。(12)RT-PCR法检测美洲大蠊多肽PAE2对裸鼠肿瘤组织中侵袭转移相关因子MMP2,MMP9,m TOR,AKT,4EBP1 m RNA含量的影响。(13)实时荧光定量法(RT-PCR)检测美洲大蠊多肽PAE2对侵袭转移相关因子ATG5,ATG7,BECLIN,PIK3C3,LC3B,P62等m RNA的影响。结果:(1)ELISA结果显示,肝癌耐药细胞中耐药细胞中AMPK含量明显升高;美洲大蠊多肽PAE2可显著降低耐药细胞中AMPK的含量(P<0.05)。RT-PCR结果显示耐药细胞中AMPK m RNA表达量显著升高,美洲大蠊多肽PAE2可显著降低耐药细胞中AMPK m RNA的表达(P<0.05)。(2)经MTT法确定AMPK激活剂的IC20为0.006m M即1.55ug/m L(分子量258.23)。并以IC20作用48h作为后续细胞试验中与美洲大蠊多肽PAE2不同剂量组合用。(3)划痕试验结果显示,耐药细胞比敏感细胞具有更强的划痕愈合能力即侵袭转移能力,而美洲大蠊多肽PAE2可抑制细胞24h,48h划痕试验愈合率(P<0.05)。美洲大蠊多肽PAE2和AMPK激活剂联用后可减弱美洲大蠊多肽PAE2对划痕愈合率的影响(P<0.05)。(4)RT-PCR结果显示,相比于敏感细胞,耐药细胞中侵袭转移正相关因子MMP2m RNA、MMP9 m RNA、AKT m RNA表达量显著增高(P<0.05),肝癌耐药组中m TOR m RNA则呈现增高趋势,而4EBP1 m RNA表达无显著变化。美洲大蠊多肽PAE2可降低耐药细胞中MMP2 m RNA、MMP9 m RNA、AKT m RNA、m TOR m RNA、4EBP1 m RNA、的表达且这种影响可通过与AICAR联用后抵消,但这种抵消效果并不呈现剂量依赖性。(5)激光共聚焦结果显示,与敏感细胞相比,耐药细胞可能具有更强的自噬能力,耐药细胞给予美洲大蠊多肽PAE2后可降低细胞中自噬流的产生,美洲大蠊多肽PAE2和AICAR合用后可加强细胞的自噬。(6)免疫细胞化学法检测自噬标志性蛋白P62在细胞中的表达,免疫细胞化学法结果显示,与敏感细胞相比,耐药细胞中P62表达量相对更少(P<0.05),而给予美洲大蠊多肽PAE2后,细胞中P62呈现高表达状态;和单独给予美洲大蠊多肽PAE2相比,美洲大蠊多肽PAE2和AICAR联用后对细胞中P62蛋白的降低效果极为显著(P<0.05)。(7)RT-PCR试验结果显示,和敏感细胞相比,耐药细胞中ATG5,ATG7,BECLIN,PIK3C3,LC3B等m RNA呈现高表达状态(P<0.05),而P62 m RNA则呈现极低表达状态(P<0.05);单独给予美洲大蠊多肽PAE2后可降低细胞中ATG5,ATG7,BECLIN,PIK3C3,LC3B等m RNA的表达,同时升高P62 m RNA的表达;美洲大蠊多肽PAE2合用AICAR后,可升高ATG5,ATG7,LC3B m RNA的表达,降低P62 m RNA的表达,但联用后各组对PIK3C3 m RNA,BECLIN m RNA的表达并无显著影响或略成降低趋势。(8)裸鼠腋下接种敏感细胞BEL-7402和耐药细胞BEL-7402/5-FU后状态稳定,饮食饮水正常,给药后裸鼠出现体重下降,消瘦等情况。接种敏感细胞的裸鼠皮下移植瘤更容易成瘤,且更稳定,耐药细胞接种肿瘤成瘤率更低,且易发生肿瘤转移。瘤体积计算结果显示,接种肿瘤后5天左右瘤稳定生长,化疗药及美洲大蠊多肽PAE2对肿瘤均有一定的抑制效果。(9)裸鼠取材后称量瘤种后可见,敏感组瘤重远远超过耐药组,美洲大蠊多肽PAE2和索拉非尼能明显降低肿瘤的重量,联合用药组降低肿瘤重量效果更为显著。脏器计算结果显示,皮下接种肝癌敏感细胞和耐药细胞对裸鼠的心、脾、肺、肝、肾指数均无明显影响;给予相应受试药物后索拉非尼组裸鼠肝脏指数明显上升,表明阳性药索拉非尼对裸鼠肝脏具有一定的保护作用。美洲大蠊多肽PAE2低剂量以及美洲大蠊多肽PAE2联合AICAR后裸鼠肺脏指数、肾脏指数升高,可能是由于药物对裸鼠脏器具有一定的保护作用。(10)血清生化指标检测结果显示,敏感组及耐药组谷草转氨酶含量明显升高(P<0.05),耐药组中谷丙转氨酶明显升高(P<0.05);单独给予美洲大蠊多肽PAE2及联合给药后裸鼠血清中肌酐尿素氮均呈现上升趋势。(11)从肿瘤组织H&E染色结果可见,与正常组裸鼠肝脏比较,接种肿瘤后裸鼠肝脏细胞排列不规则,有皱缩现象,而给予化疗药物及美洲大蠊多肽PAE2后对耐药细胞的影响并不是很显著。肝癌皮下移植瘤不规则形态,给予相应药物后肿瘤细胞均出现形态变化,细胞核缩小或核碎裂的情况,多呈不规则状,也出现成片坏死的状态。(12)裸鼠皮下移植瘤RT-PCR结果显示,与敏感组比较,耐药组肿瘤组织中侵袭转移因子MMP2、MMP9、m TOR、AKT、4EBP1等m RNA表达量均显著升高(P<0.05);给予化疗药物索拉非尼及单独给予美洲大蠊多肽PAE2后侵袭转移因子m RNA均显著降低;但PAE2联合用AICAR后仅仅可升高MMP2、MMP9、4EBP1等m RNA的表达量,对组织中m TOR、AKT等m RNA的表达无显著影响。(13)裸鼠RT-PCR结果显示,与敏感组比较,耐药组肿瘤组织中自噬相关因子ATG5、ATG7、BECLIN、PIK3C3、LC3B、P62等m RNA表达量均显著升高(P<0.05),给予美洲大蠊后自噬相关因子m RNA表达量均降低,美洲大蠊多肽PAE2联合AICAR后可升高肿瘤组织中ATG5、BECLIN、LC3B、P62等m RNA的表达,而对ATG7、PIK3C3等m RNA无显著影响,可降低肿瘤组织中P62 m RNA的表达。结论:(1)耐药细胞BEL-7402/5-FU中AMPK含量及AMPK m RNA呈高表达,美洲大蠊多肽PAE2可降低细胞中AMPK的含量及AMPK m RNA的表达。(2)肝癌BEL-7402/5-FU细胞比BEL-7402细胞具有更强的侵袭转移及自噬能力。(3)美洲大蠊多肽PAE2可抑制耐药细胞的侵袭转移及自噬的发生,且这种抑制作用可通过联用AICAR后部分抵消。(4)美洲大蠊多肽PAE2体外对肝癌细胞侵袭转移、自噬的作用可能是通过AMPK来实现的。自噬是个极其复杂的过程,美洲大蠊多肽PAE2可能只影响其中部分过程。(5)美洲大蠊多肽PAE2对裸鼠肿瘤具有很好的抑制性;接种肿瘤对裸鼠肝脏组织影响极为严重,但短期给予美洲大蠊多肽PAE2对这种损伤无明显效果。(6)接种肝癌肿瘤细胞对裸鼠的肝脏损伤较为明显,化疗药物索拉非尼对肝脏具有一定的保护作用;而化疗药物和多肽PAE2均会增加裸鼠的肾脏负担。(7)裸鼠皮下接种肿瘤后对肝功能具有损伤作用,美洲大蠊多肽PAE2则会增加裸鼠的肾脏负担,(8)在裸鼠皮下移植瘤模型中,美洲大蠊多肽PAE2对侵袭转移及自噬相关因子的影响呈现一定趋势但并不如在细胞中明显。