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羟基丙酮酸还原酶(Hydroxypyruvate reductase,HPR)是光呼吸代谢途径中催化羟基丙酮酸还原成甘油酸的一个酶,此酶的活性远高于该途径中其它酶的活性,但对它在光呼吸代谢中的作用知之甚少。本研究以HPR干涉和超表达转基因水稻为材料,探讨其生理功能,旨在进一步阐明HPR的生物学功能。同时还研究了异柠檬酸裂解酶(Isocitrate lyase,ICL)与抗非生物胁迫的关系,旨在深入了解OslCL在水稻中的作用。主要研究结果如下:
1.OsHPR2干涉转基因植株的获得通过特异引物从水稻中克隆HPR2的cDNA,选取适合片段构建了干涉载体用于转化水稻愈伤,经筛选、分化后获得转基因植株。对转基因材料进行了一系列的分子检测,获得了遗传稳定、调控效果明显的三个独立转基因纯合株系。
2.OsHPR在水稻中的功能分析将HPR-1和HPR-2的荧光蛋白表达载体与带有过氧化物酶体定位信号的荧光蛋白表达载体共转化水稻原生质体,瞬时表达结果显示,HPR-1基因的融合荧光蛋白发出点状的荧光,并与带有过氧化物酶体定位信号的载体所发荧光完全重合,表明其定位于过氧化物酶体中,而HPR-2的荧光在与原生质体中是弥散型分布,表明其定位于细胞质中。
HPR2的下调一定程度地抑制了植株生长。在三个HPR2干涉株系中,随着HPR2活性下调幅度增大,HPR-2基因表达检测不到,但HPR-1的表达量不受影响。进一步的表型及生理生化分析结果显示:随着HPR2活性的下调,HPR1活性也有所降低,但GR活性变化不显著;但此时SGAT活性呈显著提高趋势,草酸含量提高了31％。
3.超表达ICL转基因纯合后代的筛选与功能分析(1)将ICL荧光蛋白表达载体与带有过氧化物酶体定位信号的荧光蛋白表达载体共转化水稻茎原生质体,瞬时表达结果显示定位于过氧化物酶体中。
(2)通过DIG-Southern检测、RT-PCR和酶活性测定等方法,在前期获得的杂合子转基因材料的基础上,最终筛选获得了超表达ICL转基因水稻纯合株系,根、叶中的ICL,活性分别上调了40倍、24倍左右。
(3)将ICL基因重组到pMAL-c2X载体上转化大肠杆菌,经IPTG诱导4h后获得足量的目的蛋白。SDS-PAGE将目的蛋白纯化后用于免疫家兔,经三次加强免疫后获得了抗水稻ICL的多克隆抗体。Western Blot的检测表明该多克隆抗体的效价高、特异性强。
(4)超表达株系中,根叶中的ICL在转录水平和翻译水平的表达都显著提高,并且叶中的表达量显著高于根中。
(5)在正常培养条件下,过表达株系表现出比野生型生长稍慢的表型,种子发芽率和发芽势也有所降低。
(6)在超表达植株中,随着ICL酶活提高,草酸含量和乙醛酸含量同步上升,进一步证明乙醛酸是草酸合成的有效前体。
(7)超表达转基因植株对铝毒和冷胁迫的抗性明显提高,意味着ICL很可能在水稻抵御这二种逆境中起积极作用。