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目的：过观察启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同乙醇浓度的洗脱部位调节人食管癌细胞 EC9706 增殖抑制作用、细胞周期和分泌型蛋白 MMP1、MMP11、PCSK9、TREM2、IGFPB3、STX1A 表达作用,筛选对食管癌细胞有效作用部位,以期揭示研究食管癌证方不同有效部位治疗食管癌作用分子机制,探讨食管癌证候相关分子病机。
方法：1.用启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤水提物通过大孔吸附树脂 D101,并用纯水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和无水乙醇进行梯度洗脱,得到食管癌四证方不同浓度乙醇洗脱部位。2. MTT 法检测启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同浓度乙醇洗脱部位对细胞 EC9706增殖影响,寻找四证方各部位对细胞作用最明显的洗脱部位,测定这些部位的量效时效关系。3.倒置显微镜观察有效部位对细胞抑制作用明显的洗脱部位对食管癌 EC9706 细胞形态的影响。4.流式细胞术测定有效部位对食管癌细胞 EC9706 细胞周期的影响。5.Werstern-blot 法检测四方有效洗脱部位调节细胞分泌型蛋白表达的作用。
结果：1.启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤水提物经大孔吸附树脂D101用不同浓度的醇进行梯度洗脱,得到不同乙醇浓度的洗脱部位。四方的出膏率大小顺序相同,纯水洗脱部位>30%乙醇洗脱部位>50%乙醇洗脱部位>70%乙醇洗脱部位>无水乙醇洗脱部位。2.MTT法测定食管癌四证方不同浓度乙醇洗脱部位对EC9706细胞增殖影响发现,启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位对人食管癌EC9706细胞增殖有明显抑制作用,且随药物浓度增加,抑制细胞增殖呈现剂量-效应依赖关系。3.倒置显微镜下观察启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位抑制EC9706细胞生长增殖作用明显,增长缓慢。启膈散30%醇洗脱部位组细胞间接触松散,细胞呈现变圆,少量细胞固缩呈圆形或卵圆形且透亮；通幽汤50%醇洗脱部位组细胞生长较分散,细胞形态影响不大；沙参麦冬汤50%醇洗脱部位作用组细胞皱缩,透光度减低；补气运脾汤无水醇洗脱部位作用组细胞变圆,细胞间隙增大,漂浮的死细胞较多。4.启膈散30%乙醇洗脱部位组和补气运脾汤无水乙醇洗脱部位组组G0/G1期细胞比率有所上升；通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位作用的EC9706细胞G0/G1期比率降低；而各药物组S 期细胞比率均降低；各药物组G2/M期细胞比率升高,其中沙参麦冬汤50%乙醇洗脱洗脱部位部位组G2/M期细胞比率升高显著。5.运用Western-blot检测食管癌细胞EC9706内29种分泌型蛋白的表达,可检测到MMP1、MMP11、PCSK9、TREM2、IGFPB3、STX1A蛋白分子表达,启膈散30%乙醇洗脱部位能够抑制MMP1、MMP11、TREM2、IGFPB3的表达,通幽汤50%乙醇洗脱部位能够抑制STX1A的表达,沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位能够抑制MMP1、PCSK9、TREM2、 IGFPB3、STX1A的表达,补气运脾汤无水乙醇部位能够抑制MMP11、MMP11 PCSK9 TREM2 IGFPB3 STX1A的表达
结论：食管癌证方不同浓度洗脱物对食管癌细胞 EC9706 的生长均有一定抑制作用,其中启膈散 30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤 50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位抑制作用最明显。上述四个有效部位抑制细胞 EC9706 增殖作用机制与细胞周期阻滞于 G0/G1期或 G2/M 期相关。启膈散 30%乙醇洗脱部位能够抑制 MMP1、MMP11、TREM2、IGFPB3 的表达,通幽汤 50%乙醇洗脱部位能够抑制 STX1A 的表达,沙参麦冬汤 50%乙醇洗脱部位能够抑制 MMP1、PCSK9、TREM2、IGFPB3、STX1A 的表达,补气运脾汤无水乙醇部位能够抑制 MMP11、MMP11 PCSK9 TREM2 IGFPB3 STX1A 的表达