近年来,对骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)可塑性的研究进展迅速,BMSCs能够分化形成包括造血组织在内的多种组织细胞,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞,如骨、软骨、脂肪、纤维组织、上皮组织和骨髓支持基质等多种间充质组织,使人们看到了用细胞移植方法治疗神经退行性疾病的新希望。2000年Brazelton和Mezey异体移植BMSCs成功,其后才证明BMSCs可向神经细胞分化,近年来对BMSCs的促分化因子进行了大量的研究,β-巯基乙醇(beta-mercaptoethanol, BME)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、4-羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole, BHA)、五氮杂胞苷(5-azacytidine)、维甲酸(retinoic acid, RA)等相继被证实可以诱导BMSCs分化为神经元样细胞。一些生长因子如表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF),和视黄酸、胎鼠中脑或纹状体细胞悬液共同作用后,在体外也成功诱导成年大鼠和人的BMSCs分化为幼稚的神经元和胶质细胞。BMSCs还可被诱导分化为特征类型的神经元,如5-HT敏感神经元,多巴胺能神经元,但胆碱能神经元的分化一直是个难题。BMSCs分化为神经细胞的机制十分复杂,除了表达中胚层mRNA以外,还表达生殖细胞以及内、外胚层基因。其向神经元的分化受神经特异性基因表达量的调控,而并非由相应基因表达的开放与关闭控制。Sox、Pax、Notch、delta、frizzled、erbB基因以及RB、RB2/P130基因在BMSCs分化中起重要作用,最新研究表明其分化和MAPK信号通路有关。虽然有关BMSCs分化为神经元的研究进展迅速,但仍有很多问题未得到解决:首先,诱导骨髓基质干细胞分化为神经元的方案中,都存在一些缺陷,如由于化学诱导剂的毒性而不适合临床应用,某些生长因子虽然能诱导分化,但不能定向分化为特定类型等。虽然诱导BMSCs分化为多巴胺能神经元和5-HT敏感神经元已经成功,但向胆碱能神经元的分化至今未见报道。其次,诱导分化的机理研究尚不充分,尤其是分化信号的转导过程不明。以往的研究提示,在不同的细胞类型中,同一个信号传递过程可能表现出截然相反的结果,尤其是PI3K-Akt-mTOR通路和MAPK通路在BMSCs向神经元分化过程中的作用,仅见两篇报道。另外,细胞分化过程涉及到结构重建、细胞器重组、凋亡和自噬等复杂的过程,但与BMSCs向神经分化相关的自噬研究尚属空白,针对上述问题,本课题开展了一系列的研究。研究目的:筛选建立生长因子体外诱导BMSCs分化为胆碱能神经元的有效方法;通过采用特异性抑制剂,观察生长因子诱导BMSCs向胆碱能神经元分化的分化率和生存率的变化;通过检测PI3K-Akt-mTOR通路和MAPK通路蛋白以及p53表达和自噬水平的改变,初步阐明生长因子诱导BMSCs分化的信号转导机制。研究方法:(1)建立BMSCs培养和扩增方法,用不同浓度NGF诱导BMSCs分化,光镜观察分化细胞情况,从中筛选出合适的浓度;用NGF、NGF+bFGF和NGF+EGF+bFGF三种处理方式诱导BMSCs,光镜观察分化情况,免疫荧光鉴定MAP-2表达,以筛选有效组合;(2)用LY294002抑制PI3K活性,光镜观察其对生长因子诱导分化的影响,免疫荧光鉴定MAP-2和ChAT表达并计算ChAT阳性细胞率,MTT法测定分化细胞死亡率;(3)Western blot检测生长因子单独诱导、LY294002单独作用和两者共同作用时Akt、ERK激活的变化,p53表达量的变化,以及Cathepsin-B、LC3检测自噬水平,结合ChAT阳性细胞率,细胞生存率的结果,分析诱导分化的信号传导机制。实验结果:(1)NGF 100 ng/mL有很好的诱导分化作用,NGF+EGF+bFGF联合应用能诱导BMSCs分化为ChAT阳性神经细胞,分化率达60~70%。ChAT阳性细胞率有一定的时间相关性,诱导后3 h、5 h明显高于1 h,但3 h后阳性率不再升高(P>0.05,与5 h相比);单纯抑制PI3K(LY294002组)也能诱导BMSCs分化为ChAT阳性细胞,然而其阳性细胞率在每一个时间点都明显低于生长因子诱导组;在生长因子与LY294002联合处理组,ChAT阳性细胞率明显高于单纯生长因子组。(2)生长因子诱导BMSCs分化为ChAT阳性神经元后,随着时间延长细胞生存率并无明显下降,PI3K抑制使分化细胞大量死亡,生存率降低,并明显抑制生长因子诱导BMSCs分化的胆碱能神经元的生存率。(3)生长因子诱导BMSCs分化后,Akt磷酸化蛋白显著增多并持续至5 h;抑制PI3K活性后,Akt有一定的磷酸化激活,但5 h后显著下降,与对照组相比已无差别。LY294002阻断PI3K活性后,生长因子对Akt的磷酸化水平在处理后1 h没有明显改变,3 h后磷酸化水平明显增高,至5 h后仍然维持在高水平。(4)生长因子诱导后1 h ERK1/2明显激活,显著高于对照组,3 h和5 h后明显下降,PI3K抑制可明显阻滞ERK1/2的激活,但与生长因子联合作用后1 h,可增加ERK1/2的水平,3h、5h则明显低于未抑制组。(5)生长因子诱导分化后,p53表达上调,PI3K抑制后p53表达量进一步增加,同时生长因子可明显降低BMSCs诱导分化后的自噬水平,并与PI3K抑制有协同作用。结论:1.首次发现NGF、EGF和bFGF联合处理可有效诱导BMSCs分化为ChAT阳性的胆碱能神经元。2.生长因子通过激活Akt诱导BMSCs分化为胆碱能神经元,Akt激活需至一定水平才能诱导分化,存在一个“诱导阈值”。3. ERK1/2的激活是分化细胞生存的重要条件之一,高度激活的Akt诱导信号可引起ERK1/2的激活抑制,从而降低分化细胞的生存率,两者之间的平衡可维持分化神经元的高生存率。4. p53表达上调不是降低由BMSCs分化的胆碱能神经元生存率的主要因素,但可以协同ERK1/2激活抑制所致的分化细胞的生存率降低。自噬可能不参与诱导BMSCs向胆碱能神经元的分化过程。