牙齿的发生和发育是由上皮和间充质在一系列信号分子组成的信号网络的精确调控下完成的。因此牙齿的生物性再生至少需要两种细胞:上皮源性细胞和间充质源性细胞。目前牙源性间充质细胞的替代研究进展较快而且取得了可喜的成绩,例如成体的牙髓干细胞、骨髓基质细胞均被证明具有形成牙髓-牙本质复合体的功能。在寻找牙源性上皮细胞替代细胞方面虽然也进行了一些研究,如诱导胚胎时期口腔粘膜上皮或皮肤表皮以及成体骨髓来源的细胞向成釉细胞转化,但这些研究多建立在应用胚胎早期组织基础之上,以出生后组织为来源寻找替代细胞的研究进展有限。寻找能够向牙源性上皮方向分化的成体或出生后组织来源的细胞对解决牙齿再生研究中上皮源性种子细胞来源的瓶颈问题具有重要意义。本研究着重探讨出生后1d仔鼠的皮肤来源的表皮细胞向牙源性上皮方向分化以及参与牙齿发育的能力。本课题主要进行了以下几方面的研究:1.牙乳头间充质细胞对皮肤表皮细胞牙向分化的体外诱导研究(1)皮肤表皮细胞的体外培养与鉴定以出生1d的SD仔鼠背部皮肤为组织来源进行表皮细胞培养。采用胞外基质的黏附法对原代培养的表皮细胞进行筛选,对筛选细胞的增殖能力、细胞表型以及细胞周期的特性进行分析。结果表明所经传代培养所得到的细胞具有良好的生物学特性,能够表达表皮干细胞相对特异性标识物CK19、CK14;流式细胞周期分析显示所培养的细胞多数处于G0/G1期。上述检测结果表明本实验所培养的表皮细胞中未分化细胞的含量较多。(2)牙乳头间充质细胞的体外培养采用显微分离法分离出生后1d SD仔鼠下颌第一磨牙的牙乳头,免疫组织化学染色结果表明分离获得的牙乳头组织中没有牙源性上皮的残余。采用酶消化法进行牙乳头间充质细胞(DPMCs)的原代培养并对细胞的纯度、表型、增殖能力以及矿化能力等特性进行分析。结果表明分离培养的DPMCs没有上皮性标记物pan-CKs的表达,但却能够稳定的表达VIM,RT-PCR分析显示所培养的DPMCs没有牙源性上皮特异性基因AMGN、AMBN的表达。进一步检测结果表明DPMCs具有较强的增殖能力和矿化诱导液诱导后分泌矿化基质的能力。结果证明本研究所获得的DPMCs没有上皮细胞污染、具有较强增殖活性和矿化能力。(3)牙乳头间充质细胞对表皮细胞牙向分化的体外诱导研究通过分层培养建立牙乳头间充质细胞对表皮细胞牙向分化的体外诱导模型,以牙胚细胞条件培养液为辅助诱导液对表皮细胞进行牙向分化诱导。结果表明经过体外6d的培养,表皮细胞能够表达牙源性上皮标记物AMBN,AMGN基因。进一步免疫细胞化学染色分析表明这些细胞能够稳定表达CK14,从而说明在该诱导条件下表皮细胞能够向牙源性上皮方向分化而不是向角质细胞方向分化。该诱导方案的建立为寻找非牙源性上皮细胞替代牙源性上皮细胞的研究奠定了实验基础。2.牙乳头间充质细胞对皮肤表皮细胞牙向分化的体内诱导研究(1)表皮细胞与牙乳头间充质细胞相互作用诱导模式的筛选建立了间充质细胞团块与表皮皮片、间充质细胞与表皮细胞混合接种支架材料、间充质细胞团块与表皮细胞团块分层组合、间充质细胞与表皮细胞混合细胞团块4种不同的牙齿再生上皮-间充质间的重组方案,培养14d后的结果表明间充质与表皮细胞混合团块培养体系中可以观察到类牙齿样结构,而其他三组中均无此类结构的形成。本实验最终筛选间充质细胞与表皮细胞混合团块体内培养的方法作为皮肤表皮细胞与牙乳头间充质细胞相互作用的体内诱导模式。(2)牙乳头间充质细胞对表皮细胞牙向分化的体内诱导研究采用间充质细胞与表皮细胞/组织混合团块体内培养的重组方案,分别将出生1d仔鼠的表皮皮片/细胞与原代的DPMCs按1;2的体积比混合重组后形成细胞团块,同时设立单纯的皮肤表皮皮片、表皮细胞和单纯的牙乳头间充质组织、DPMCs移植作为阴性对照。体内培养14d后进行组织学、免疫组织化学分析,结构显示,表皮皮片与DPMCs的重组体中可见由釉质、成釉细胞、牙本质、前期牙本质已及成牙本质细胞构成的不规则的牙齿样结构,表皮细胞与DPMCs形成的重组体中可见具有一定牙冠形态的牙胚样结构。进一步免疫组织化学染色分析和PKH26荧光标记均显示釉质形成细胞为皮肤来源的细胞。本实验首次证明了来自出生后1d的SD仔鼠皮肤的表皮细胞在一定的诱导条件下能够向牙源性上皮方向转化,同时还证明了本研究中所采用的诱导方法能够有效的促进皮肤表皮细胞向牙源性上皮方向转化。(3)牙乳头间充质细胞对出生后不同时间点皮肤表皮牙向分化的体内诱导研究分别取出生后4d、7d的仔鼠的背部表皮,将其与出生1d的仔鼠的DPMCs混合制备成细胞团块,经体内培养后进行组织学观察。结果表明2组重组体中均无釉质样结构的形成。本实验表明在同1d仔鼠表皮相同的诱导条件下,4d及7d仔鼠的表皮不具备向牙源性上皮方向转化的能力。3.牙髓间充质对皮肤表皮细胞牙向分化的体内诱导研究(1)牙乳头间充质细胞与牙髓干细胞生物学行为及成牙本质能力的比较研究采用有酶消化法及有限稀释的方法进行大鼠牙髓干细胞(DPSCs)的原代培养,并将所获得的DPSCs与DPMCs进行增殖能力、体外矿化能力、体内形成牙本质能力的比较,结果显示DPSCs具有与DPMCs相似的增殖能力、矿化和形成牙本质的能力。(2)牙髓间充质对出生1天仔鼠皮肤表皮细胞牙向分化的体内诱导研究通过分别建立牙髓干细胞、牙髓中1/3、牙髓根尖1/3组织与出生1d仔鼠表皮细胞的重组体观察牙髓间充质对表皮来源细胞牙源性上皮方向分化的诱导能力。将上述重组体体内培养14d后组织学结果显示3组中均无牙釉质样结构的形成。本部分实验结果证明虽然牙髓间充质来源于牙胚间充质且具有同DPMCs相似的形成牙本质-牙髓复合体的能力,但在对非牙源性上皮牙向分化诱导能力方面存在较大差异。综上所述,本研究首次证明了出生后1d SD仔鼠皮肤来源的表皮细胞在出生后1d的SD仔鼠的DPMCs的诱导下能够向牙源性上皮方向分化。相同的诱导模式下,牙髓间充质的诱导不能使皮肤来源的表皮细胞实现牙向分化。本研究为牙齿再生研究走向临床奠定良好的实验基础,也为其他多胚层组织和器官的重建开辟新途径,为牙齿再生研究牙源性上皮提供了新的种子细胞来源。