研究背景研究显示肾间质病变与慢性肾功能衰竭进展关系密切,肾间质纤维化几乎是各种肾脏疾病进展到终末期的共同途径和主要病理基础。研究其病理过程和发生机制,寻找延缓和阻断肾纤维化新靶标,是目前国内外肾脏病研究的热点方向。多种细胞因子和生物活性物质参与肾间质纤维化的发生发生发展过程,各调节因子通过生物信号传导机制联系起来,形成完善的调节反馈系统,调节机体的病理生理过程。肾间质纤维化的发生、发展过程较为复杂,主要包括成纤维细胞活化、增殖及表型转化,转变为分泌α-平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞,生成细胞外基质(extracelluarmatrix, ECM)的能力明显增强,在多种细胞因子作用、炎症细胞浸润等因素调节下,造成ECM生成/降解平衡失调,ECM大量积聚,从而促进肾间质纤维化的发展。在该病理过程中,有多种细胞因子参与,其中促进纤维化的因子包括转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、血小板源性生长因子(PDGF)等,抑制纤维化的因子包括：肝细胞生长因子(HGF)、核心蛋白多糖(Decorin)、骨形态形成蛋白-7(BMP-7)等。在众多促纤维化的因子中,TGF-β1被认为是最重要的促纤维化因子,很多研究试图通过抑制TGF-β1阻止肾纤维化进展。然而,要将其研究应用于临床尚有很多问题需要解决,例如,目前的方法还很难在人体肾脏产生显著反义抑制TGF-β1表达的寡义核苷酸来抑制TGF-β1的表达；且TGF-β1也是一种抗炎因子,长期抑制TGF-β1易诱发炎症反应,研究发现TGF-β1基因敲除的小鼠可死于多发性炎症。因此寻找抑制肾间质的纤维化进程的更特异性的药物作用靶点,在治疗肾脏纤维化中具有重要意义。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是降解ECM的重要酶系,MMPs主要有两方面功能,一是降解全部ECM成分,二是激活其他MMPs,形成级联效应。MMPs均以酶原的形式分泌到ECM中,在激活剂作用下脱去前肽产生具有生物活性的MMPs发挥生物效能。基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)可抑制MMPs酶原及酶活性,对调节ECM形成／降解具有重要作用。肾小管间质纤维化主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型间质胶原及Ⅳ型膜胶原、糖蛋白和蛋白多糖的堆积,MMPs/TIMPs平衡失调肾间质纤维化发病的关键,而MMP-9/TIMP-1为其中最重要的一对。TIMP-1可与MMP-9前体(pro-MMP-9)形成稳定的复合体,阻碍pro-MMP-9的自我激活；同时TIMP-1抑制已活化的MMP-9的活性,直接与活化的MMP-9 Zn2+活性中心按1：1比例发生不可逆结合,阻断或抑制MMP-9活性,而MMP-9活性高低直接影响肾间质纤维化的进程。在不同病因所致的肾间质纤维化病程发展中均存在MMPs/TIMPs的功能紊乱。不同实验方法观察可有不同的结果,但有一种共同趋势,即TIMPs高表达,和(或)MMPs的活性下降。寻找MMPs激活剂或表达促进剂或者TIMPs的抑制剂,有可能成为预防和治疗肾间质纤维化的新方法。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,英文名称为Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL),又称为lipocalin-2,是lipocalin家族新成员,是1993年K Jeldsen在中性粒细胞中发现的一种小分子量分泌性蛋白。NGAL除具有lipocalin家族共有疏水基结构外,尚存在一游离的巯基,可与MMP-9前体等其他分子结合,为其发挥特殊的生物学作用奠定了基础。NGAL在人体表达于多种组织器官,如：支气管、胃、小肠、肾脏、前列腺、胸腺等。NGAL具有参与炎症趋化与免疫应答反应；参与肾小管上皮细胞的形成、修复；参与肿瘤的发生发展等多种生物学作用。研究发现NGAL对调节MMP-9/TIMP-1具有一定作用。NGAL可结合于MMP-9上保护MMP-9不被降解。一般情况下,MMP-9是以Pro-MMP-9形式贮存于细胞内,分泌到细胞外之后,只有切去N端的一段序列,MMP-9才表现活性。通常,Pro-MMP-9在细胞内主要以四种方式存在：单体、同源二聚体、NGAL与Pro-MMP-9以分子间二硫键结合形成的异源二聚体(NGAL/Pro-MMP-9)以及此异源二聚体与金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)形成的三元复合物NGAL/ Pro-MMP-9/TIMP-1。在这种三元复合物中,Pro-MMP-9仍可被激活为有活性的MMP-9,但活性会有所降低。然而当此三元复合物中的TIMP-1通过它的游离N-端结构域去结合和抑制其它的MMPs时,又可形成NGAL/Pro-MMP-9/ TIMP-1/MMPs四元复合物。而当这种四元复合物被活化时,Pro-MMP-9被激活成MMP-9的活性反而比三元复合物时的活性高许多倍。很显然NGAL明显具有调节这些复合物的能力,甚至从某种程度上来讲,NGAL具有抵消复合物中TIMP-1抑制MMP-9活性的作用。故通过探讨NGAL在肾间质纤维化模型中表达情况及与,对于探索其在肾间质纤维化中的作用机制及为治疗肾间质纤维化可能提供新思路。研究发现急性药物相关性肾炎患者肾组织中NGAL在近端小管的表达较正常人增强,NGAL表达量与间质-小管损害呈负相关,说明NGAL在急性肾小管间质损伤中起到一定保护作用,但具体机制尚不明确,推测NGAL可能在肾间质纤维化中发挥一定作用。Jaya Mishra在急性小鼠急性缺血-再灌注损伤模型中发现,予NGAL治疗可显著减少小管细胞组织病理学损伤,增加近端小管数目,推测NGAL可能诱导肾间质细胞向小管上皮细胞转换而诱导肾小管上皮细胞再生。目前国内外对NGAL研究多集中于其在乳腺癌等肿瘤发生机制中的作用及在肾脏急性缺血-再灌注损伤、肾移植及心肺分流术等多种因素诱发的急性肾功能损害的早期检测指标等。对于NGAL在肾间质纤维化中的作用研究较少,以上研究均证明NGAL在肾间质纤维化过程中可能起到一定的调节作用,故探讨NGAL在肾间质纤维化模型中表达情况及作用,对于探索其在肾间质纤维化中的作用机制及为治疗肾间质纤维化可能提供新思路。研究目的1、动态观测单侧输尿管梗阻大鼠梗阻侧肾组织NGAL、MMP-9及TIMP-1的表达变化,探讨NGAL与MMP-9、TIMP-1在肾纤维化发展过程中的相关关系;2、探讨NGAL在肾小管间质纤维化发展中的作用机制。研究方法1、制作单侧输尿管梗阻模型将48只雄性SD大鼠随机分为单侧输尿管梗阻组(UUO)及假手术组(SOR),UUO组行左侧输尿管结扎术,SOR组仅游离左侧输尿管不结扎。术后第1、4、7、14天分别处死每组中的6只大鼠,取左肾(梗阻侧肾脏)行HE和Masson染色。2、用免疫组化ELiVisionTMplus法检测肾组织NGAL、MMP-9、TIMP-1及FN的表达情况。3、用SPSS13.0对结果进行数据分析。结果1、HE、MASSON染色评估肾纤维化程度UUO组第1天远端小管无扩张,肾间质无明显水肿；术后第4天远端小管扩张,肾间质轻度水肿,间质内散在淋巴细胞、巨噬细胞浸润；术后第7天远端小管扩张明显,肾间质明显水肿,近端小管出现扩张,炎性细胞浸润进行性加重并伴有纤维细胞增生；术后第14天可见肾小管、集合管扩张呈囊状,部分上皮细胞变性、坏死,肾小管结构破坏,管腔塌陷,炎性细胞浸润。2、FN免疫组化结果SOR组大鼠FN在肾小球、肾小管基底膜及肾间质有少许表达,UUO组随